基于生物分子网络的黄芪-丹参药对干预慢性心力衰竭作用机制预测研究

章轶立 李园 刘俊杰 张建 杨双杰 王旨引 王娟 赵慧辉 王伟

摘要：目的  借助生物网络及模块化分析方法探索黄芪-丹参药对治疗慢性心力衰竭（CHF）的潜在作用靶点和信号，初步探索益气活血法治疗CHF可能的生物学机制。方法  综合利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）、DisgeNet和HPO数据库，分别获得药物有效成分、作用靶点及疾病相关治疗靶点，构建药对与疾病间的关键靶标网络，基于基因本体数据库GO和KEGG通路数据库确定靶标基因、蛋白质分子功能、细胞内定位及其所参与的生物学反应和通路。结果  黄芪-丹参药对治疗CHF的作用机制可能与调节机体内激素的分泌、转运、代谢，机体循环系统调节，血液循环调节等有关，并可能作用于昼夜节律、固醇类激素合成、缺氧诱导因子、组氨酸代谢、肾素血管紧张素系统、基底转录因子等相关信号通路。结论  黃芪-丹参药对可能通过调节相关物质基础发挥治疗CHF作用，“昼夜节律调控”可能成为益气活血法治疗CHF新的思路。

关键词：网络药理学;黄芪;丹参;心力衰竭;生物网络

中图分类号：R285;R2-05    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）02-0093-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201901117

Study on Prediction Mechanism of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma Medicinal Pair for Intervention of Chronic Heart Failure Based on Biomolecular Network

ZHANG Yili1， LI Yuan2， LIU Junjie1， ZHANG Jian1， YANG Shuangjie1， WANG Zhiyin1，

WANG Juan1，3，4， ZHAO Huihui1，3，4， WANG Wei1，3，4

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;

2. Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China;

3. Key Laboratory of Basic Research on Prescription and Syndrome， Ministry of Education， Beijing 100029， China;

4. Beijing Key Laboratory of Prescription and Syndrome Basic Research， Beijing 100029， China

Abstract： Objective To explore the potential targets and signals of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma medicinal pair for the treatment of chronic heart failure （CHF） by means of biological networks and modular analysis methods; To preliminarily explore the possible biological mechanism of Yiqi Huoxue therapy for CHF. Methods The TCMSP and BATMAN-TCM， DisgeNet and HPO databases were used to obtain the active ingredients， targets and disease-related therapeutic targets respectively. The key target network between medicinal pairs and diseases was constructed. Target genes， protein molecular functions， intracellular localization， and the biological responses and pathways involved were determined based on GO and KEGG pathway database. Results The mechanism of Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma medicinal pair for the treatment of CHF may be related to the regulation of hormone secretion， transport， metabolism， regulation of circulatory system， regulation of blood circulation， etc.， and may act on circadian rhythm， steroid hormone synthesis， hypoxia induction factors， histidine metabolism， renin angiotensin system， basal transcription factors and other related signaling pathways. Conclusion Astragali Radix-Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma medicinal pair may play a role in the treatment of CHF by regulating the related substances. The regulation of circadian rhythm may become a new idea for the treatment of CHF by Yiqi Huoxue therapy.

Keywords： network pharmacology; Astragali Radix; Salviae Miltiorrhizae et Rhizoma; heart failure; biological network

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是一组复杂的临床综合征，为各种心脏疾病的严重或终末期阶段[1]。目前临床治疗CHF主要药物集中在利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素受体阻滞剂（ACEI/ARB）和β受体阻滞剂[2]。在现代医学常规治疗基础上，结合中医学相应干预措施，可提高疗效、缩短病程、减少药物不良反应，对CHF临床诊疗方案的补充具有积极作用。《慢性心力衰竭中医诊疗专家共识》[3]、《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》[4]对该病中医病机（本虚标实、虚实夹杂）认识一致，辨证治疗首推益气活血类中药。

“黄芪-丹参”是益气活血治法的代表性药对，包含该药对的相关中成药临床辅助治疗CHF疗效满意[5-6]，并被相关中西医临床实践指南推荐[3，7]。网络药理学融合了药学、生物学、计算机学及复杂网络分析等多学科的新技术与新成果，从化合物、靶点、信号通路等多角度入手，实现中药研究的综合网络分析，在预测和辨识中药活性成分群及作用靶点、阐明作用机制、解释组方规律、发现新适应证及新活性化合物等方面，具有独特优势和巨大潜力。本研究通过构建中药-成分-靶标-通路复杂网络关系，建立中药-化学成分-作用靶标-疾病靶标多维度关联，以期揭示黄芪-丹参药对的物质基础及其分子机制，为中医药治疗CHF的理-法-方-药系统研究提供范例。

1  资料与方法

1.1  药物化学成分及作用靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[8]分别筛选黄芪和丹参的主要化学成分（OB≥30%，DL≥0.18），根据每个化学成分的PubChem_Cid编号进行标准化处理。通过中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）[9]，根据与已知药物的结构相似性评价和反向分子对接等方法，预测目标化合物的潜在作用靶点（P≤0.05，score≥20），获得黄芪-丹参主要成分的潜在作用靶点，并根据靶点对应的Uniprot编号进行规范和去重。

1.2  疾病相关靶点筛选

通过DisgeNet数据库（http：//www.disgenet.org）[10]和HPO数据库（https：//hpo.jax.org/）[11]获取CHF相关靶点，根据其对应的Uniprot编号进行规范和去重。

1.3  药物与疾病靶点相互作用网络的构建及可视化

将黄芪-丹参作用靶点数据集与CHF相关靶点数据集进行重叠，发现药物与疾病的交集基因。基于String数据库（https：//string-db.org/cgi/network.pl）获取已知的蛋白质相互作用（PPI）关系，将黄芪-丹参作用于CHF的作用靶点映射其中，得到黄芪-丹参作用于CHF的PPI网络。利用Cytoscape3.0软件实现该网络的可视化和分析。

1.4  GO生物学过程及KEGG信号通路分析

通过Cytoscape3.0的ClueGO插件对黄芪-丹参与CHF靶点相互作用网络进行GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析（P<0.01），预测黄芪-丹参药对治疗CHF的潜在作用机制。

2  结果

2.1  药物化学成分相关靶点

TCMSP检索得到黄芪的化学成分18个，BATMAN-TCM检索存在高度关联蛋白成分10个，分别为Isoflavanone、Mairin、Hederagenin、Folic Acid、Kaempferol、Astrapterocarpan、（3R）-3-（2-Hydroxy-3，4- Dimethoxyphenyl）Chroman-7-Ol、1，7-Dihydroxy-3，9- Dimethoxy Pterocarpene、Quercetin、（24S）-24- Propylcholesta-5-Ene-3Beta-Ol。TCMSP检索得到丹参的化学成分57个，BATMAN-TCM检索存在高度关联蛋白成分26个，分别为Miltipolone、Salviolone、Methylenetanshinquinone、Arucadiol、（Z）-3-[2-[（E）-2- （3，4-dihydroxyphenyl）vinyl]-3，4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid、α-amyrin、Dehydrotanshinone ⅡA、2-isopropyl- 8-methylphenanthrene-3，4-dione、Tanshinone Ⅵ、Deoxyneocryptotanshinone、Miltirone、Przewalskin B、Tanshinone Iia、Salvianolic Acid J、Manool、Digallate、Microstegiol、Neocryptotanshinone、Gamma-Sitosterol、Poriferasterol、MiltiononeⅠ、Neocryptotanshinone Ⅱ、Isotanshinone Ⅱ、Sclareol、Sugiol、Tanshinone Ⅱb。根据2种药物的36種化学成分检索得到相关靶点1927个，去重后共748个。

2.2  药物与疾病蛋白质相互作用网络

DisgeNet數据库检索得到CHF相关靶点69个，其中与黄芪-丹参药对的重叠靶点有16个（ACE、TNF、ADRB2、REN、AGTR1、RYR2、ACE2、TBPL1、UGT1A1、CALM1、AGT、CYP11B2、ADORA2B、ADORA2A、IFNG、HDC）。黄芪-丹参治疗CHF的PPI网络见图1。自由度表示PPI网络中与该节点直接相互作用的节点数目，节点越大与其相互作用的节点数越多;接近中心性反映网络中某一节点与其他节点间的接近程度，节点颜色越深其接近中心性越强;关联性评分反映网络中各节点间的关联性强弱，两节点间的连线越粗其关联性越强;中介中心性反映经过一个点的最短路径的数量，该值高的节点处在其他点对相互之间的捷径上。其中，自由度最高的前10个蛋白分别为INS、EDN1、KNG1、TNF、POMC、CALM1、CALM2、F2、AGT、NPS，接近中心性最高的前10个蛋白分别为INS、EDN1、CALM1、CALM2、KNG1、TNF、F2、ACE、POMC、NFKB1;中介中心性最高的前10个蛋白分别为NFKB1、GTF2B、INS、HDC、TNF、IRF1、POMC、IFNG、KNG1、CALM2。

2.3  潜在作用机制分析

根据对黄芪-丹参治疗CHF的PPI网络进行GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析，发现共涉及407个GO功能和78条KEGG信号通路。GO生物学过程主要包括激素分泌、转运、代谢，循环系统调节，血液循环调节等。KEGG信号通路涉及昼夜节律调节（circadian entrainment）、固醇类激素合成（steroid hormone biosynthesis）、缺氧诱导因子信号通路（HIF-1 signaling pathway）、组氨酸代谢（histidine metabolism）、肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system）、基底转录因子（basal transcription factors）相关信号通路等，见表1、表2、图2。

3  讨论

本研究基于中医整体观念和现代整合药理学思路，预测黄芪-丹参为代表性药对的益气活血法治疗CHF的有效成分及潜在作用靶点，有助于体现中药多成分、多靶点、协同作用的特点，并可视为对“以法统方”“异病同治”等中医学特色理论内涵的有益探索，可为方证相应研究和新药开发提供全新的选择与向导。

本研究发现，黄芪-丹参药对可能参与调节CHF昼夜节律的生物学过程。已有研究表明，心血管系统的功能组织显示出明显的昼夜节律性[12]。心血管疾病的相关危险因素，如激素水平[13]、睡眠周期[14-15]及血压、心率[16-17]等均能影响心血管系统。相关临床和基础研究也显示，在心律调节[18]、血压[19]、心率[20]等方面，心力衰竭患者的症状体征具有一定昼夜节律性。目前，动物实验及临床研究初步探索了黄芪、丹参对激素调节[21]、睡眠改善[22]等的影响，提示以黄芪-丹参药对为代表的益气活血法治疗CHF机制研究，不应仅着眼于单一药物的单一成分调控临床某一/些症状指标，其可能通过调节这些指标背后的“昼夜节律”起效，在实验设计与结局评价过程中，可尝试从益气活血法调控昼夜节律这一角度进行系统研究，挖掘更多昼夜节律潜在的特异性指标，发现更多调节昼夜节律的代表性药物。

此外，本研究探索出黄芪-丹参药对可能作用于固醇类激素合成、肾素血管紧张素系统、缺氧诱导因子信号通路等进一步干预CHF。神经内分泌机制在心脏收缩性心力衰竭的发展中发挥了核心作用，其中肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的激活对心脏有直接不利影响[23]。近年研究发现，大脑中存在着完整的RAAS，对心血管系统具有重要调节作用，且在CHF发生、发展中起到关键作用[24-25]。而益气类中药具有抑制血液血管紧张素Ⅱ、肾素、醛固酮过度激活的作用[26]。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在心力衰竭疾病进程中作用机制复杂，既对负荷过重引起的肥大心脏有保护作用，也能在心力衰竭终末期起致病作用[27]，并与抑制肌质网Ca-ATP酶2 mRNA的表达密切相关[28]。有研究表明，丹参酮ⅡA可能通过上调HIF-1α表达保护脑组织，且该保护作用与HIF-1α表达量呈正相关，在一定范围内增加丹参酮ⅡA的剂量可以提高HIF-1α的表达[29]。此外，黄芪主要活性成分芒柄花素与HIF-1表达存在浓度-效应关系，低浓度促进其表达，高浓度抑制其表达[30]。

本研究结果表明，黄芪-丹参药对主要活性成分可针对多个靶点、多条通路发挥抗心力衰竭作用，可能参与调节机体内激素的分泌、转运、代谢，机体循环系统调节，血液循环调节等，并可能作用于昼夜节律、固醇类激素合成、缺氧诱导因子、组氨酸代谢、肾素血管紧张素系统、基底转录因子等相关信号通路。本研究结果可为益气活血法干预心血管相关疾病及气虚血瘀证候调节的机制研究提供一定参考，并为进一步探索该治法临床运用及验证性研究提供基础。

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（收稿日期：2019-01-10）

（修回日期：2019-02-26;编辑：陈静）

基金项目：国家重点研发计划（2017YFC1700100、2017YFC1700102）

通讯作者：王伟，E-mail：wangwei@bucm.edu.cn