黄金胶囊对2型糖尿病大鼠肝组织eIF2α及GRP78表达的影响

余臣祖 秦双红 高攀 张朝宁

摘要：目的  觀察黄金胶囊对2型糖尿病（T2DM）大鼠肝组织eIF2α、GRP78表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法  采用高糖高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射制作T2DM大鼠模型。成模大鼠随机分为模型组、罗格列酮组和黄金胶囊低、中、高剂量组，另取8只大鼠为正常组。各给药组给予相应药物灌胃，模型组和正常组给予生理盐水灌胃，连续10周。Western blot和RT-PCR分别检测大鼠肝组织eIF2α、GRP78蛋白和mRNA的表达，HE染色观察肝组织病理形态。结果  与正常组比较，模型组大鼠eIF2α、GRP78蛋白和mRNA表达均明显升高（P<0.05）;与模型组比较，各给药组大鼠eIF2α mRNA表达明显降低（P<0.05），罗格列酮组较黄金胶囊中、低剂量组差异有统计学意义（P<0.05），黄金胶囊高剂量组与罗格列酮组作用相当（P>0.05）。HE染色显示黄金胶囊各剂量组大鼠肝脏病理损害减轻，高剂量组减轻最明显。结论  黄金胶囊可抑制模型大鼠肝组织eIF2α、GRP78表达的上调，减轻病理损害，从而改善肝组织内质网应激，降低血糖。

关键词：黄金胶囊;糖尿病;内质网应激;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）02-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906074

Effects of Huangjin Capsules on Expressions of eIF2α and GRP78

in Liver of Type 2 Diabetes Mellitus Rats

YU Chenzu1，2， QIN Shuanghong1， GAO Pan1， ZHANG Chaoning1

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730101， China;

2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China

Abstract： Objective To explore the effects of Huangjin Capsules on the expressions of eIF2 and GRP78 in the liver of type 2 diabetes mellitusrats （T2DM）; To explore its possible mechanism of action. Methods T2DM rat model was established by high-sugar and high-fat diet combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin. The model rats were randomly divided into model group， rosiglitazone group， Huangjin Capsules low-， medium- and high-dosage groups. Another 8 rats were chosen as normal control group. Each administration group was given relevant medicine for gavage， while model group and normal control group were given saline for gavage， for consecutive 10 weeks. Western blot and RT-PCR were used to detect theprotein and mRNA expressions of eIF2α and GRP78 in rat liver tissue. HE staining was used to observe the pathological morphology of liver tissue. Results Compared with the normal control group， the protein and mRNA expressions of EIF2 and GRP78 significantly increased in the model group （P<0.05）. Compared with model group， eIF2 mRNA expressions decreased in both rosiglitazone group and Huangjin Capsules medium- and low-dosage groups， with statistical significance （P<0.05）. The effects of Huangjin Capsules high-dosage group were the same as rosiglitazone group. HE staining showed that the liver pathological damage was alleviated in the rats in Huangjin Capsules groups， and the most significant reduction was observed in the high-dosage group. Conclusion Huangjin Capsules can inhibit theup-regulation of expressions of eIF2 and GRP78 in liver tissue of model rats and reduce pathological damage， so as to improve the liver endoplasmic reticulum stress and reduce blood glucose.

Keywords： Huangjin Capsules; type 2 diabetes mellitus; endoplasmic reticulum stress; rats

2型糖尿病（T2DM）是由多种原因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性、系统性疾病，其病理机制是胰岛素分泌不足和/或胰岛素抵抗（IR）[1-2]。目前研究显示，内质网应激（ERS）、IR与糖尿病的发生密切相关[3-4]。黄金胶囊由温胆汤化裁而来，全方具有清热解毒、运脾化浊功效。前期研究显示，黄金胶囊能降低血糖，改善IR[5-6]。本实验通过观察肝组织ERS标志分子eIF2α、GRP78的表达，探讨黄金胶囊治疗T2DM的可能作用机制。

1  实验材料

1.1  动物

雄性Wistar大鼠60只，SPF级，体质量（200±20）g，2～3月龄，甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，自由摄食饮水。

1.2  药物

黄金胶囊（黄连9 g，鸡内金12 g，法半夏9 g，竹茹15 g，枳实9 g，陈皮9 g，茯苓15 g，炙甘草9 g），甘肃中医药大学附属医院，批号171103;罗格列酮片，重庆涪陵制药厂有限公司，批号20170203。

1.3  主要试剂与仪器

链脲佐菌素（STZ，北京索莱宝科技有限公司，批号641J03），eIF2α（GeneTex，批号42774），GRP78（GeneTex，批号42606）。台式电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司，型号DZF-OB），Western blot转膜仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYY-6D），Western blot电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYY-6D），摇床（德国IKA，型号SK-O180-E），酶标仪（美国BIO-RAD，型号iMark），恒温培养箱（澳柯玛股份有限公司，型号BC/BD-208HNE），血糖仪（美国强生，型号02211601B），灭菌锅（上海申安医疗器械厂，型号LDZX-50KBS），高速低温台式离心机（德国Eppendorf公司，型号TGL-16），超低温冰箱（美国Thermo，型号DW-HL528），实时定量PCR仪（美国Agilent，型号Applied Biosystems Step One PlusTM），涡旋振荡器（美国赛洛捷克，型号MX-S），小型离心机（美国赛洛捷克，型号D1008E），NanoDrop核酸浓度测量仪（美国Thermo，型号NanoDropOne）。

2  实验方法

2.1  分组、造模及给药

普通饲料适应性喂养1周，禁食12 h，尾静脉采血测空腹血糖。血糖4.77～7.77 mmol/L大鼠入选[7]，其中5只大鼠不达标。入选的55只大鼠按体质量编号，按随机数字表法分为正常组8只、造模组47只，造模组大鼠给予高糖高脂饲料喂养，正常组给予普通饲料喂养[8]。自由饮水，饲养4周后，记录大鼠体质量，造模组大鼠空腹12 h，单次腹腔注射STZ 35 mg/kg，72 h后测定大鼠血糖，空腹血糖（FBG）≥11.0 mmol/L或餐后血糖≥16.7 mmol/L大鼠纳入模型实验组，STZ注射后2周末复测大鼠血糖，未达标者均剔除，不作为实验用鼠。将成模大鼠随机分为模型组、罗格列酮组和黄金胶囊高、中、低剂量组，每组8只，成模大鼠均继续给予高糖高脂饲料喂养，正常组给予普通饲料喂养，按人与大鼠体表面积折算及前期实验研究[6]予相应剂量药物，黄金胶囊高剂量2.025 g/kg、中剂量1.265 g/kg、低剂量0.675 g/kg，罗格列酮0.5 mg/kg，正常组和模型组给予等量生理盐水。每日1次，连续10周。

2.2  指标检测

灌胃结束后，隔夜禁食、禁水12 h，采血测FBG;取肝组织置于冻存管，-80 ℃冰箱保存备检。

2.2.1  RT-PCR检测eIF2α、GRP78 mRNA表达

采用Trizol法从大鼠肝组织中提取RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，采用两步法PCR反应程序：95 ℃、120 s;95 ℃、30 s，60 ℃、60 s，40个循环，以β-actin为内参，用2-ΔΔCt计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1，引物设计合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2.2.2  Western blot检测eIF2α、GRP78蛋白表达

取200 mg冷冻的肝组织样本提取组织蛋白，BCA法行蛋白定量，蛋白样本变性，SDS-PAGE，转膜，免疫杂交反应，最后曝光显影观察，运用Quantity One软件进行光密度定量分析，以各目的蛋白条带灰度值与相应内参的条带灰度值比计算各目的蛋白相对表达量。

2.2.3  HE染色

取肝组织4%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，镜下观察肝组织病理形态学变化。

3  统计学方法

采用SPSS20.0統计软件进行分析，计量资料以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，多重比较用LSD法，若方差不齐时用Games-Howell方法分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  黄金胶囊对大鼠空腹血糖的影响

与正常组比较，模型组大鼠FBG明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，罗格列酮组和黄金胶囊各剂量组大鼠FBG明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;黄金胶囊中、低剂量组效果不及罗格列酮组，差异有统计学意义（P<0.05）;黄金胶囊高剂量组与罗格列酮组作用相当，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

4.2  黄金胶囊对大鼠肝组织eIF2α、GRP78 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织eIF2α、GRP78 mRNA表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较，罗格列酮组和黄金胶囊各剂量组大鼠肝组织eIF2α mRNA表达明显降低（P<0.05），黄金胶囊中、低剂量组效果不及罗格列酮组，差异有统计学意义（P<0.05），黄金胶囊高剂量组与罗格列酮组作用相当，差异无统计学意义（P>0.05）;与罗格列酮组比较，罗格列酮组和黄金胶囊高、中剂量组GRP78 mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与罗格列酮组比较，黄金胶囊中剂量组效果不及罗格列酮组，差异有统计学意义（P<0.05），黄金胶囊高剂量组与罗格列酮组作用相当，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

4.3  黄金胶囊对大鼠肝组织eIF2α、GRP78蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织eIF2α、GRP78蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，罗格列酮组和黄金胶囊组大鼠肝组织eIF2α、GRP78蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），黄金胶囊中、低劑量组效果不及罗格列酮组，差异有统计学意义（P<0.05），黄金胶囊高剂量组与罗格列酮组作用相当，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表4、图1。

4.4  黄金胶囊对大鼠肝组织病理形态的影响

正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝索排列规则，细胞核结构清晰，染色均匀，未见明显的脂肪变性、坏死，无界面性炎症及纤维化;模型组大鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，染色变浅，肝细胞体积变大，出现明显的气球样变性，并伴有大量的炎性细胞浸润及肝组织脂肪沉积;罗格列酮组大鼠大部分肝小叶结构接近正常，肝细胞排列较为整齐，偶见少量炎性细胞浸润，可见少量肝细胞气球样变性及脂肪性病变，肝脏脂肪组织沉积明显减少，较模型组病变程度明显减轻;黄金胶囊各剂量组大鼠肝小叶结构逐渐清晰，肝索排列基本规则，肝细胞气球样变性及脂肪性病变明显减轻，炎细胞浸润及肝组织脂肪沉积均明显减少，黄金胶囊高剂量组改善最明显。见图2。

5  讨论

研究显示，胰岛素与胰岛素受体结合后主要通过2条途径将信号下传至效应器：一是经胰岛素受体底物（IRS）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的代谢信号通路;另一个通路是经促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）调节基因转录、细胞增殖的生长信号通路[9-10]。研究发现，ERS可通过影响上述2条信号通路诱导肝脏IR的形成，促进T2DM的发生[11]。

内质网是哺乳动物细胞重要的Ca2+贮存器，也是蛋白质合成与翻译后修饰，多肽链正确折叠与装配的重要场所[12]。某些情况下如缺氧缺血、高血糖、化学毒物等使内质网腔Ca2+耗竭、蛋白质糖基化抑制、二硫键错配，均可导致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔中蓄积，发生ERS。GRP78是促进蛋白质正确折叠的重要分子伴侣，GRP78表达上调是ERS的重要标志之一。发生ERS时，PERK与GRP78解离后，发生自身磷酸化，并使eIF2α磷酸化，阻止新蛋白质的合成。PERK与eIF2α的磷酸化被认为是发生ERS的标志[13-15]。

中医认为，人体是一个有机整体，五脏六腑功能协调，气血化生有源，则病无由以生;若外感六淫或七情致五脏六腑功能失调，气、血、津液运化失常，痰、饮、浊、瘀等停滞，对机体产生毒害作用而致发病，这种有形的病理产物皆可称为浊毒。情志失调，肝气郁结，横逆克犯脾土，致脾胃虚弱，运化失司，痰饮由生;肝气不舒，久郁化火，木火邢金，煎津成痰;肝气郁结，脾胃失司，气机运行受阻，血之统帅作用减弱，血停不运而为瘀;气血停滞，脉道受阻，瘀血内生而化为血浊。浊毒既是致病因素，又是病理产物，可流注于四肢关节、脏腑百骸而致病。浊毒流于肝脏，影响肝的正常生理功能，而引发肝脏内质网应激，产生IR，致糖尿病的发生和发展。

黄金胶囊切合糖尿病浊毒病理机制，方中黄连味苦性寒，归心、脾、胃、胆、大肠经，清热燥湿、泻火解毒、止消渴，鸡内金甘、平，归脾、胃、小肠、膀胱经，具有醒脾消食、化积滞、缩小便之功，二者共为君药，对于脾胃一泻一补，对于痰浊一解一化，标本兼治，起到化浊解毒之功效，以治消渴;法半夏体滑而性燥，健脾燥湿，温胃降逆，竹茹开胃土之郁，清肺金之燥，胆和则烦呕自止，陈皮以辛散之，以苦燥之，调中而快膈，消痰而导滞，枳实破气，痰化而痞胀消，四者共为臣药;茯苓为佐，味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有益脾除湿、利窍宁心之功，脾健而痰无以生;炙甘草味甘气温，补三焦元气而散表寒，调和诸药，为使药。全方寒温并用，补泻兼施，达到清热解毒、运脾化浊之效。

本实验采用高脂高糖饲料喂养加腹腔注射链脲佐菌素制作T2DM大鼠模型。病理结果显示，模型组大鼠肝脏出现明显的病理损害，作为ERS发生的分子标志，eIF2α、GRP78蛋白与mRNA表达均明显升高，表明内质网功能紊乱对肝细胞功能造成影响进而导致肝脏病理损害的发生，T2DM大鼠肝脏ERS程度较正常大鼠显著增强。与模型组比较，黄金胶囊各剂量组大鼠肝组织eIF2α、GRP78蛋白及mRNA表达明显降低，肝脏病理损害明显改善，提示黄金胶囊可通过降低eIF2α、GRP78表达起到保护肝组织ERS的作用。

综上所述，链脲佐菌素诱导的T2DM模型大鼠肝组织中存在eIF2α、GRP78基因表达的异常，黄金胶囊通过降低eIF2α、GRP78表达而改善ERS，从而发挥其治疗T2DM的作用。

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（收稿日期：2019-06-06）

（修回日期：2019-07-09;编辑：华强）

基金项目：甘肃省自然科学基金（1610RJZA074）

通讯作者：张朝宁，E-mail：1754648867@qq.com