磁性固相萃取-超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法测定渔业水环境中的12种磺胺类抗生素残留

高磊，王鹏，陈中祥，吴松,3，汤施展，孙承宇，黄丽,4，覃东立*

(1. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，哈尔滨 150070; 2. 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141;3. 东北农业大学，哈尔滨 150030; 4. 东北林业大学，哈尔滨 150006)

随着中国养殖行业的迅速发展，兽药抗生素的使用量也在日益增加[1]。其中，磺胺类药物(sulfanilamide, SAs)是人工最早合成的抗生素之一，具有价格低廉、抗菌谱广、性质稳定等诸多优点，被广泛用于人工养殖和临床治疗，已成为目前使用量较大的抗生素[2]。但SAs却难以被生物吸收和代谢，具有难降解的特点[3]。据研究，有一半以上的SAs原药及其代谢产物会随生物粪便和尿液排出体外，通过淋溶、渗透等方式进入生态环境中，对土壤、地表水及地下水造成抗生素污染[4-5]。SAs在水产养殖中应用广泛，对水产养殖中的细菌性竖鳞病、烂鳃病及鞭毛虫病等有良好的防治效果[6]。但其会随食物链不断富集，对人体造成致畸、致突变和致癌等危害[7-8]。因此，快速检测渔业水环境中磺胺类药物的残留研究是十分必要的。

水环境中抗生素残留检测的常见方法为仪器检测法，如高效液相色谱(HPLC)法[9-14]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[15-17]等。HPLC法仅能通过保留时间对目标化合物进行定性，当基质复杂导致待测目标化合物与杂质一同流出时，无法对其准确定性定量。而LC-MS/MS法的检测限更低，可以满足水环境中痕量抗生素残留检测的要求，并且有更高的准确度和更好的灵敏度，现已成为多组分分析的主流检测方法，但前处理手段却是制约该法检测的瓶颈。

固相萃取(SPE)因具有良好的富集能力而被应用于不同的前处理过程中[18]，且已经被应用于水样品中SAs的检测[19-20]，但由于商业化固相萃取小柱的价格较为昂贵，影响了其应用范围。磁性固相萃取(magnetic SPE，MSPE)是一种以磁性材料作为吸附载体的固相萃取技术，其主要原理是将磁性吸附剂直接加到待测样品溶液中，通过振荡吸附使得吸附剂和待测物充分接触混匀，达到动态吸附解析平衡，然后再通过外加磁场的作用将目标物从样品基质中迅速分离出来，进行洗脱等步骤。以磁性材料为萃取剂的MSPE技术具有萃取高效、步骤简单及可批量处理等特点，已成为当前材料、环境等多个学科的研究热点。且MSPE法直接将萃取剂分散到水样品中，解决了传统的SPE过程中常出现的柱堵塞难题。此外，MSPE吸附剂易于扩散，短时间内即可达到吸附动态平衡[21-22]，已成功应用于水体中四环类[23]、除草剂[24]等多类物质的分析检测。

为能够快速、准确检测养殖水体中SAs残留情况，本研究选用碳纳米管作为载体，使用制备的磁性碳纳米管(MCNTs)作为渔业水环境中磺胺类抗生素的吸附剂，结合超高效液相色谱串联质谱法，建立了渔业水环境中多种磺胺类抗生素的分离分析方法，以期丰富水体中SAs残留检测方法，为开展相关调查研究提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-串联三重四级杆质谱仪(ACQUITY UPLC H-Class & XEVO TQ-S，美国沃特世公司)，配有ESI离子源；氮气发生器(美国毕克公司)；超声波清洗机(KQ-700E，昆山超声仪器有限公司)；氮吹仪(N-EVAPTM111，美国Organomation公司)；涡旋混匀器(德国IKA公司)；纯水器(美国Millipore公司)；水浴锅，烘箱等。碳纳米管(CNTs)、甲醇、乙腈、乙醇、甲酸、氯化铁、氯化亚铁及氨水等试剂耗材均购置于上海安谱实验室。

1.2 标准溶液配置

磺胺噻唑(ST，99.1%)、磺胺嘧啶(SDZ，99.0%)、磺胺甲基嘧啶(SM1，99.2%)、磺胺二甲基嘧啶(SM2，99.6%)、磺胺甲基异噁唑(SMZ，99.0%)、磺胺多辛(SO，99.14%)、磺胺异噁唑(SFZ，98.7%)、磺胺喹噁啉(SOX，98.0%)、磺胺间甲氧嘧啶(SMX，95.0%)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDM，99.0%)、磺胺氯哒嗪(SCP，100.0%)及磺胺甲噻二唑(SMZO，99.3%)抗生素标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司。准确称取一定量各抗生素标准品，用乙腈溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成100 mg/L的SAs单标及混合标准贮备溶液，-18 ℃保存。储备液用乙腈稀释，配制成各浓度的混合标准工作溶液，于4 ℃保存，现用现配。

1.3 磁性碳纳米管的制备

MCNTs制备参照课题组前期建立方法[25]，并做适当修改。用3 mol/L的HNO3纯化CNTs，加热回流6 h，而后经超纯水清洗，离心洗涤多次，干燥研磨备用。随后取2.0 g活化后的CNTs，加入到250 mL的三口瓶中，用100 mL的超纯水冲洗瓶壁，随后加入17.4 mmol的FeCl3·6H2O及8.7 mmol FeCl2·4H2O，超声30 min。然后水浴加热三口瓶，当温度达到80 ℃后，加入10 mL的氨水溶液，继续反应60 min。待反应结束后，用超纯水冲洗多次(至中性)，无水乙醇冲洗2次，置于60 ℃烘箱中干燥，备用。

1.4 样品前处理

量筒取100.0 mL水样品置于250 mL烧杯中，采用滤纸进行过滤，滤液收集至另一250 mL烧杯中。加入30 mg制备好的MCNTs。用冰醋酸或氨水调节pH到7[26]，振荡吸附20 min。萃取完成后，用超强磁铁吸附MCNTs，小心倾倒上层水样，然后采用1 mL 甲醇×3次(共计3 mL甲醇)涡旋超声洗脱，每次30 s，收集洗脱液，洗脱液于40 ℃下氮气吹近干，移液器吸取液相色谱初始流动相将残渣定容至1 mL，涡旋30 s，用2.5 mL注射器将定溶液过0.22 μm有机相过滤膜，最后采用超高效液相色谱串联质谱检测，用Masslynx分析实验数据。

1.5 色谱质谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×50.0 mm色谱柱，柱温为30 ℃，流速为0.3 mL/min。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，洗脱梯度程序为：0～2.0 min，95%A；2.0～4.2 min，95%～5%A；4.2～6.4 min，5%A；6.4～6.5 min，5%～95%A；6.5～8.0 min，95%A。

质谱条件：离子源，电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压，3.0 kV；偏转电压，30 V；离子源温度，150 ℃；去溶剂温度，450 ℃；去溶剂气流量，800 L/Hr；锥孔气，250 L/Hr；锥孔电压，20 V；碰撞气流量，0.14 mL/min；选择多反应监测(MRM)；磺胺类抗生素的反应监测模式的各参数如表1所示。

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱条件的优化

根据塔板理论，研究采用了粒径1.7 μm超高效液相色谱柱，相比于传统的HPLC可得到更尖锐的峰形，同时还采用了更短的色谱柱(5 mm)可以在短时间内完成多组分的分离。根据欧盟对化合物的要求，一般选取两对特征离子对定性，其中的一对作为定量离子对。参照文献[27-28]方法，对12种磺胺类抗生素的MRM质谱条件进行优化。配置每种物质的标准品单标，采用质谱的混合模式在MS1全扫描模式下，得到待测物的母离子质核比。随后在MS2模式下以0～100 V不同的碰撞能量扫描化合物的两个子离子，根据其丰度变化，得到最高响应值下的子离子质核比及碰撞能量参数，优化参数结果如表1所示。

表1 多反应监测模式下12种磺胺类抗生素的质谱参数Tab.1 Mass spectral parameters for SAs in MRM

注：“*”示定量离子对。

2.2 萃取条件的优化

2.2.1 MCNTs添加水平对回收率的影响

MCNTs的添加水平是影响萃取效率其最终回收率关键因素。本实验分别选用10、20、30、40及50 mg磁性材料加入到100 mL水样中进行实验，其最终回收率如图1A所示。由图1A可以看出，MCNTs添加量为10 ～30 mg时，随着添加量的增加12种磺胺类抗生素回收率逐渐升高；当添加量超过30 mg后，抗生素回收率基本不变。因此，确定最优条件为向100 mL水样中添加30 mg MCNTs。

2.2.2 萃取时间的选择

在磁性固相萃取中，萃取时间是影响萃取效果的关键因素，在保证可得到满意的回收率的情况下，选择较短的萃取时间会提高分析效率。本实验分别考察了5、10、20、30及40 min萃取对回收率的影响。由图1B可以看出，当萃取时间在5 ～20 min时，吸附效果逐渐变好，回收率逐步提高；当超过20 min后，回收率基本保持不变，说明已达到萃取饱和状态。故选取20 min作为最优萃取时间。

图1 萃取剂添加量(A)及萃取时间(B)对磺胺回收率的影响
Fig.1 Effects of different amounts of MCNTs (A) and extraction time (B) on recoveries

2.2.3 洗脱剂的选择

萃取结束后，需选择合适的洗脱剂将目标抗生素洗脱下来。本实验选取了丙酮、甲醇和乙腈3种洗脱溶剂，结果发现，甲醇可以很好地将磺胺类抗生素洗脱下来，并且价格具有一定优势。另外，洗脱体积影响后续氮气吹干时所用的时间，本实验依次选用了1、3及5 mL作为洗脱体积进行了实验，结果发现当洗脱剂为1 mL×3次(每次超声30 s)时回收率就可以达到80%以上。因此洗脱剂选用甲醇，每次1 mL，洗脱3次。

2.3 方法线性范围及检出限

分别配置20.00、50.00、100.00、200.00、500.00和1 000.00 ng/L浓度梯度的标准溶液100 mL，按照1.4处理后，采用优化后的最佳条件对其进行前处理，再经进行UPLC-MS/MS分析测定。结果表明，质量浓度在20.00～1 000.00 ng/L范围内线性良好，其相关系数r大于0.995，检出限为10.00 ng/L。

选取低浓度(10.00 ng/L)、中浓度(100.00 ng/L)和高浓度(1 000.00 ng/L)3个浓度梯度进行质控样品加标实验，以纯净水的加标回收率进行校正，测定加标回收率，发现方法回收率均在78.06%～97.86%。日内精密度在1.15%～8.79%，日间精密度在2.13%～9.59%(表2)。

表2 磺胺类抗生素(12种)的加标回收率Tab.2 Recoveries and precision for the SAs in fishery water

2.4 实际样品分析

选取4个哈尔滨周边养殖池塘(各1个样品)、哈尔滨道里区室内自来水(1个样品)和某品牌瓶装矿泉水(1个样品)，共计6个实际样品。在优化后的最佳条件下进行前处理并检测，发现哈尔滨一处池塘有磺胺二甲基嘧啶(SM2)残留。经计算，该样品中SM2含量为42.40 ng/L，总离子流图如图2C所示。空白样品和加标样品的总离子流图见图2A和图2B。

图2 总离子流图与池塘水中SM2残留色谱图
A：空白样品；B：标准样品(250.0 ng·L-1)；C：实际样品(其中箭头指示部分为SM2两个离子对的放大色谱图)。
Fig.2 The total ion chromatogram of the blank sample (A); the standard SAs (B); and the real sample (C)
The arrow indicates the extracted ion chromatograms of SM2.

3 结论

本实验建立了MSPE-UPLC-MS/MS法测定渔业水环境中磺胺类抗生素残留的高效分析方法，所分析的磺胺类抗生素在20.00～1 000.00 ng/L表现出较好的线性，相关系数全部大于0.995。在不同加标浓度下，12种抗生素回收率都在78.06%～97.86%范围内，且相对标准偏差均小于9.59%。该方法具有较为广泛的线性范围，并且可以一次振荡多组样品，适用于大批量样品检测，MSPE用时较少(约为 25 min)，且具有有机试剂消耗少、环保安全及重现性佳等特点，因此能够应用于实际渔业水环境样品的检测、监测中，具有很好的应用前景。