磁性固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定环境水样中12种喹诺酮类抗生素残留

魏 丹，国 明，吴慧珍，陶星名

(1．杭州万向职业技术学院 健康与现代农业系,杭州310023; 2．浙江省化工研究院 分析测试中心,杭州310023;3．浙江树人大学 生物与环境工程学院,杭州310023)

喹喏酮类抗生素是在母核4-喹酮相应位置引入不同基团进行人工合成的一种抗生素。喹喏酮类药物具有广谱、耐药性低、不良反应少、使用方便、价格便宜等优点,被广泛应用于临床、畜牧和水产等领域,但是由于长期对喹诺酮抗生素的不合理使用和排放,造成了该类抗生素对土壤及其周围地表水的污染。这种抗生素不仅会抑制环境中有益微生物的活性,刺激病原菌产生抗药性,对陆生或水生生态系统产生负面效应,还会通过饮用水、食物链等方式进入人体进而影响人体健康。由于水体中该类抗生素的种类繁多且含量较低(多以ng·L－1级的低质量浓度存在[1])。因此,建立该类抗生素残留的快速灵敏的检测方法十分重要。

目前,喹诺酮类抗生素残留的测定方法主要有微生物法、免疫检测法[2]、高效液相色谱法[3-5]、液相色谱-质谱法、高效液相色谱-质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法[6]和高效毛细管电泳法等。其中,液相色谱-质谱法具有灵敏高效、快速准确和专属性强等优势,在喹诺酮类药物残留分析领域得到广泛应用[7]。磁固相萃取(MSPE)是一种以磁性材料为吸附剂的固相萃取(SPE)技术,与传统的固相萃取方法相比,该方法更简便、快速、经济,其在分析检测的领域具有很好的应用前景。

本工作用零价纳米铁(nZVI)和氧化石墨烯(GO)制备了GO＠n ZVI磁性材料,这种复合材料中具有大π共轭体系、比表面积较大、在水溶液中的分散性良好等特点,可以和喹诺酮药物分子形成π-π共轭结构,对喹诺酮类抗生素具有较大的吸附容量和良好的回收率。本工作先用磁性材料对目标物进行固相萃取,然后再进行高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定,以期为该类抗生素的检测提供技术支持和参考。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Agilent 1290 infinity型高效液相色谱仪;6460 Triple Quad 型质谱仪;Milli-Q 型超纯水器;KQ-100DE型超声波清洗器;Seven Easy S30型p H 计。

GO 储备溶液:在1．0 g GO 中加1 L的水,超声分散15 min,加水配制成1 000 mg·L－1的 GO 储备溶液,常温保存。

12种喹诺酮抗生素标准储备溶液:分别称取0．100 0 g的沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星、吡呱酸、西诺沙星、噁喹酸、萘啶酸于100 m L容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得到1 000 mg·L－1标准储备溶液,于4 ℃冰箱内避光保存。使用时,以含有0．2%(体积分数,下同)甲酸的20%(体积分数,下同)甲醇溶液稀释至所需浓度。

依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、噁喹酸、吡呱酸、萘啶酸和西诺沙星等喹诺酮抗生素标准品的纯度为99．0%;甲醇、乙腈均为色谱纯;二氯甲烷,乙酸,氨水,乙酸铵等为分析;nZVI 的纯度大于99．5%;GO 的纯度大于99%;试验用水为超纯水(电阻率不小于18．2 MΩ·cm)。

1．2 仪器工作条件

1)色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(3．0 mm×100 mm,1．8μm),柱温35 ℃;流量0．3 m L·min－1;进样量10μL;流动相为甲醇(A)和1%(体积分数)甲酸溶液(B);梯度洗脱程序:0～1 min时,A 为10%;1～7 min时,A 由10%升至40%;7～10 min 时,A 由40%升至60%;10～11 min时,A 由60%升至90%;11～12 min时,A由90%降至10%,保持3 min。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI),采用正离子检测模式;多反应监测(MRM)模式;干燥气氮气,温度为300 ℃,流量5 L·min－1;雾化气氮气,压力310 k Pa;鞘气为氮气,温度250 ℃,流量10 L·min－1;毛细管电压3 500 V。

12种喹诺酮的质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab．1 MS parameters

1．3 试验方法

1．3．1 GO＠nZVI磁性材料的制备

常温下,将1．0 g的nZVI加入至10 m L 水中,超声分散15 min。然后再加入50 m L 的GO 储备溶液,涡旋振荡30 s,用磁铁分离下层黑色沉淀物,即得到GO＠nZVI磁性材料。

1．3．2 测定方法

采集的环境水样经0．22μm 微孔滤膜过滤除去悬浮颗粒物。称取15 mg的GO＠nZVI磁性材料于10．0 m L烧杯中,依次用甲醇、水清洗和活化后,加入10 m L 水样,用乙酸和氨水调节酸度至p H 7．0,振荡5 min,使GO＠nZVI磁性材料对喹诺酮抗生素进行充分吸附;用磁铁将GO＠nZVI材料分离收集在烧杯底部,弃去上清液。在磁性材料中加入1．0 m L 氨水,超声10 min 进行洗脱,重复2次,合并洗脱液并吹氮至近干,用100μL 水溶解残留物,过0．22μm 微孔滤膜,滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2．1 GO＠nZVI磁性材料表征

对GO＠nZVI磁性材料进行了SEM 和FTIR表征,见图1。

图1 GO/nZVI的SEM 图和FTIR 图Fig．1 SEM image and FTIR spectrum of GO/nZVI

由图1(a)可以看出:nZVI被GO 片层结构附着,其表面相连团聚在一起,形成蓬松的结构,直径为100～500 nm,这是由于nZVI与GO 混合后,在静电相互作用力的驱动下,两者迅速沉降所致。从图1(b)可以看出:GO 的特征峰如－COOH(1 725 cm－1)、C－O－C(1 224 cm－1)和C－OH(1 042 cm－1)的特征峰完全消失,GO/nZVI磁性材料的红外吸收谱线和nZVI的完全重叠,说明GO已紧密附着于nZVI的表面。

2．2 磁性固相萃取条件的优化

吸附和洗脱过程是影响磁性固相萃取效果的关键步骤,试验考察了吸附剂用量(5,10,15,18,20 mg)、吸附时间(1,2,3,5,8,10 min)、洗脱剂种类(甲醇、水、p H 9氨水溶液、p H 11氨水溶液和氨水)和洗脱时间(5,10,15 min)对10 m L 的10．0μg·L－1喹诺酮混合标准溶液的萃取回收率的影响,见图2。

由图2(a)可知:12种喹诺酮的萃取回收率随吸附剂用量的增加而增加,当吸附剂用量大于15 mg时,萃取回收率基本保持稳定。考虑到吸附剂用量越多越不利于洗脱,试验选取吸附剂的用量为15 mg。如图2(b)所示:当吸附时间为5 min 时,12种喹诺酮的萃取回收率较大,继续增加吸附时间,萃取回收率基本保持不变,试验选择的吸附时间为5 min。由图2(c)可知:和甲醇、水、p H 9的氨水溶液、p H 11的氨水溶液相比,氨水对目标物的萃取回收率较高,试验选择氨水作洗脱剂。由图2(d)可知:萃取回收率随洗脱时间的延长而增加,当洗脱时间大于10 min时,萃取回收率基本不变。试验选择的洗脱时间为10 min。

2．3 磁性材料的可重复利用性

可重复利用性是评价磁性材料的重要指标之一。按照测定方法用磁性材料对喹诺酮抗生素进行磁固相萃取,重复使用10次后,磁性材料对目标物的萃取回收率较第一次的减少约10%,说明GO＠nZVI磁性材料具有良好的可重复利用性。

2．4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件对12种喹诺酮混合标准溶液进行测定,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线,各喹诺酮抗生素的线性范围均为1～50μg·L－1,线性回归方程、相关系数见表2。

以3倍信噪比计算检出限(3S/N),10 倍信噪比计算测定下限(10S/N),结果见表2。

2．5 精密度试验

按照测定方法对含有5．0,10,20μg·L－1混合标准溶液的空白样品进行测定,以5次重复测定结果的相对标准偏差(RSD)计算日内精密度,连续5 d测定结果的RSD 计算日间精密度,结果见表3。

添加了20μg·L－1混合标准溶液的空白水样的色谱图见图3。

图2 12种喹诺酮抗生素在不同条件下的固相萃取回收率的影响Fig．2 Solid phase extraction recovery of the 12 quinolone antibiotics obtained under various conditions

表2 线性参数、检出限、测定下限和精密度试验结果Tab．2 Linearity parameters，detection limits，lower limits of determination and results of tests for precision

2．6 回收试验

按试验方法对杭州地区3种空白环境水样(西溪湿地水、自来水和茶园灌溉用水)中的喹诺酮类抗生素的含量进行测定,均未检出喹诺酮类抗生素残留。以这3种环境水样为基底进行3 个浓度水平(5．0,10,20μg·L－1)的加标回收试验,结果见表4。

表3 精密度试验结果Tab．3 Results of tests for precision

图3 空白水样中混合标准溶液的色谱图Fig．3 Chromatogram of mixed standard solution added in blank water sample

表4 回收试验结果Tab．4 Results of test for recovery

本工作建立了磁性固相萃取-HPLC-MS/MS测定环境水样中12种微量喹诺酮类药物残留的方法,与其他文献报道的方法相比[8-11],该方法具有绿色环保、检出限低、重现性好等特点,适用于环境水样中微量喹诺酮类药物的富集及检测。