固相萃取-离子色谱法测定血液中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸

2020-04-24赵志东张显强王晓卉

理化检验-化学分册 2020年3期

赵志东，孟娇，张显强，王晓卉

(1．贵州警察学院实验中心,贵阳550005; 2．贵州警察学院法律系,贵阳550005;3．贵州警察学院刑技系,贵阳550005)

草甘膦是目前世界上使用量最大的除草剂之一,被广泛应用于控制农田或非耕作用地中一年生或多年生杂草的生长[1]。草甘膦是一种生物蛋白质合成抑制剂,其通过抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸盐合成酶(EPSPs)的活性,使植物体内蛋白质合成受阻,致使植物死亡[2]。草甘膦原药在美国毒性分级中被评定为III,被认为是相对较安全的农药,但经商品化改造的草甘膦的毒性是前者的数倍[3],会造成人体上皮细胞膜的损伤[4]、细胞中的血浆损伤和线粒体功能受损[5],甚至有致癌的风险。

目前草甘膦的测定方法主要有分光光度法[6-7]、高效液相色谱荧光法[8-11]、离子色谱法[12-14]、气相色谱-质谱法[15-16]、液相色谱-串联质谱法[17-21]等。检测对象多为水、农产品、蔬菜等,对人血液中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的检测鲜见报道[12]。本工作用乙腈沉淀蛋白后,通过3个不同的固相萃取柱对血液进行净化,然后用离子色谱法对其进行了分析,以期满足对血液中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸的检测需要。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

Dionex Aquion型阴阳离子色谱仪,配Dionex AERS-300 4 mm 阴离子抑制器;MS3 basic型涡旋混合器;KQ 500DE 型数控超声波清洗器;PUERLAB Ultra ELGA 型纯水仪;TGL-16C 型离心机;岛津AUW 320型电子天平。

Dionex On GuardⅡ固相萃取柱,包括ionex On GuardⅡRP 柱 (RP 柱,1．0 m L)、Dionex On GuardⅡAg柱(Ag柱,1．0 m L)和Dionex On GuardⅡNa柱(Na柱,1．0 m L)。

混合标准储备溶液:称取草甘膦标准品102 mg和氨甲基膦酸标准品101 mg,用水溶解并定容至100．0 m L,得到1．0 g·L－1混合标准储备溶液,置于4 ℃冰箱中避光保存。

混合标准溶液系列:将混合标准储备溶液稀释,配制成10,20,50,100,200,500,1 000,2 000,5 000,10 000μg·L－1混合标准溶液系列。

草甘膦和氨甲基膦酸标准品的纯度分别为98%,99%。

乙腈为色谱纯,试验用水为超纯水。

1．2 仪器工作条件

采用Dionex IonPac AS-19 阴离子分析柱(250 mm×4 mm)及 IonPac AG-19 保护柱(50 mm×4 mm);抑制电流165 m A,流量1 m L·min－1;定量环25μL;柱箱温度30 ℃,电导检测池温度35 ℃;采用不同浓度的氢氧化钾溶液进行淋洗,梯度淋洗程序:0～5 min 时,氢氧化钾浓度为10 mmol·L－1;5～13 min 时,氢氧化钾浓度为10～65 mmol·L－1;13～20 min时,氢氧化钾浓度为65 mmol·L－1;20～25min时,氢氧化钾浓度为10 mmol·L－1。

1．3 试验方法

用移液器移取1 m L 血液样品,置于15 m L 塑料离心管中,分别加入5,100,1 000 mg·L－1混合标准溶液100μL,再加入2 m L乙腈,用于沉淀蛋白质,最后加入水6．9 m L,振荡5 min,以7 000 r·min－1转速离心10 min,取上清液分别过经活化的RP柱、Ag柱、Na柱及有机相针式滤器,去除血液中的有机相及离子,弃去前面3 m L流出液后,开始收集滤液,在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与讨论

2．1 前处理条件的优化

固相萃取柱在使用前需要进行活化。RP 柱用10 m L 甲醇和 10 m L 水活化,Ag 柱和 Na 柱用10 m L水活化,流量均为1 m L·min－1,活化时间均为30 min。

用乙腈沉淀蛋白后,血液样品中还残留大量脂肪、碳水化合物等有机成分,会与氢氧化钾淋洗液发生皂化反应,造成色谱图中基线波动,影响色谱峰峰形和定性、定量分析结果,甚至会导致仪器损伤。本工作在用乙腈沉淀蛋白后,使用了RP 柱净化血液样品,可除去血液中的有机成分。

人血液中大量存在的Cl－和Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金属离子会影响草甘膦的峰形及其定性、定量分析。Ag柱通过Ag＋型磺酸树脂可以去除Cl－,Na柱通过Na＋型磺酸树脂可以去除Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金属离子,保护色谱柱不被伤害。

本工作考察了使用RP 柱、RP 柱＋Ag柱、RP柱＋Ag 柱＋Na柱时对血液样品中 Cl－和 Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金属离子的对应色谱峰强度和回收率的影响,见表1。

表1 经过不同萃取柱处理后血液样品中草甘膦和氨甲基膦酸的峰面积和回收率(n＝3)Tab．1 Peak areas and recovery of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in blood samples treated with different extraction columns(n＝3)

过RP柱＋Ag柱＋Na柱后,血液中Cl－的回收率为0．211%,而草甘膦和氨甲基膦酸的回收率均高于与99%,说明Ag柱对Cl－的去除效果很好,且对草甘膦和氨甲基膦酸的定量结果无影响。试验选择 RP 柱＋Ag 柱＋Na 柱去除 Cl－和 Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金属离子。

2．2 色谱条件的优化

在仪器工作条件下,使用Dionex IonPac AS-19高容量阴离子分析柱及IonPac AG-19保护柱可以实现血样中草甘膦、氨甲基膦酸与等干扰组分的良好分离,草甘膦和氨甲基膦酸的保留时间分别为17．25,18．38 min。草甘膦和氨甲基膦酸的色谱图见图1。

2．3 标准曲线、检出限和测定下限

按仪器工作条件对混合标准溶液系列进行测定,分别以草甘膦的质量浓度和氨甲基膦酸的质量浓度为横坐标,两者对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,草甘膦和氨甲基膦酸的质量浓度均在0．01～10 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,线性方程分别为y＝0．056 8x＋0．001 5和y＝0．052 5x－0．003 9,相关系数分别为 0．999 3,0．999 1。