双孢蘑菇二次发酵料高温菌的提取与鉴定

隽加香 王倩 陈辉 张津京 宋晓霞 肖婷婷 陈明杰 黄建春

摘要    本试验采集了双孢蘑菇工厂制备的二次发酵料，通过配制不同类型的选择培养基，采用涂布分离的方法，于温度为55 ℃、湿度为60%～70%的恒温培养箱中培养，从二次发酵料浸出液中得到高温菌单菌落，再进行纯化，然后提取纯化后的高温菌基因组DNA，采用NCBI物种相似度比对进行鉴定。结果表明，在马丁氏培养基上得到棕黑腐质霉（Humicola fuscoatra）和短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis），相似度对比均达到99.4%以上。

关键词    双孢蘑菇;二次发酵料;高温菌

中图分类号    S646.11        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）06-0076-01                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

随着人们生活水平的提高，市场对于食用菌的需求越来越大，生产食用菌需要制备大量培养料，制备良好的培养料中含有大量的有益微生物，其中有些重要微生物必须在培养料的发酵过程中才能正常生长，有些重要微生物可以在分离纯化后人工培养。双孢蘑菇（Agaricus bisporus（J.E.Lange）Imbach.）又称白蘑菇，是世界栽培面积最广的食用菌，占全球食用菌产量的38%。双孢蘑菇培养料腐熟过程中各类高温菌大量繁殖，如嗜热性细菌、嗜热性放线菌、嗜热性霉菌，参与一次发酵与二次发酵中的各种生理生化过程，与有害微生物存在竞争关系，对发酵料的pH值、EC值、碳氮比、营养物质含量等有密切的影响，最终影响到培养料的质量与双孢蘑菇的产量。倘若能从培养料中分离提取并鉴定出小部分起重要作用的嗜热性微生物，可以加深对发酵料腐熟的机理与过程的认识，可以为培养料制备过程提供指导，也有利于培养料微生物添加剂的开发。一般此类嗜热性微生物最适宜的温度范围为45～55 ℃，最高温度范围为60～90 ℃，最低温度范围为25～45 ℃，而嗜温性微生物与嗜冷性微生物的最高温度范围分别为30 ℃和43 ℃。本试验以55℃作为筛选培养的温度，能够保证筛选分离出的微生物均为嗜热性微生物。

1    材料与方法

1.1    试验材料

从上海联中食用菌的双孢蘑菇二次发酵料料仓中部采集出的表面有明显白色放线菌的出仓二次料，用无菌自封袋封装。

马丁氏培养基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，琼脂20.0 g，孟加拉红0.033 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 000 mL;121 ℃，30 min灭菌;用于分离培养丝状真菌。

1.2    高温菌提取与纯化

1.2.1    出仓二次发酵料的活化。将用无菌自封袋封装的二次发酵料置于55 ℃、湿度约为60%的恒温培养箱中活化12 h。

1.2.2    筛选分离与纯化。取5～10 g二次发酵料浸没于无菌水中，振荡10 min，吸取一定量的二次料浸出液，将浸出液稀释出10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍、1 000 000倍6个浓度梯度，将6个浓度的菌液分别涂布于上述各类培养基上。

将已涂布有菌液的各类培养基倒置于55 ℃、湿度为60%～70%的培养箱中，恒温培养12 h，即可肉眼看见不同的单菌落;待圆形菌落半径扩大至1 cm左右时，用接种针挑取各菌落外围的微生物接种至同类培养基中进行纯化培养，纯化操作的次数取决于纯化程度。

将双孢蘑菇二次料浸出液稀释后直接涂布在马丁氏培养基上，筛选出重要微生物的概率较小，因而使用这种培养基时，在方法上要做一定改良。改良方法如下：用镊子夹取2 cm左右的二次料秸秆接种在培养基上，倒置于55 ℃、湿度約为70%的培养箱中，恒温培养1 d，即可发现有菌类在培养基上生长，菌落半径扩大至1 cm左右时，用接种针挑取菌落外围的微生物接种至同类培养基中进行纯化培养。

1.3    鉴定

参照上海桑尼生物科技有限公司物种鉴定方法[1]。

2    结果与分析

2.1    纯化菌种在不同培养基上的生长情况

涂布有菌液的马丁氏培养基倒置于55 ℃、湿度60%恒温培养箱中，12 h后肉眼可看见生长的菌落，并继续进行纯化培养。观察发现，该菌落生长缓慢，60 h左右可完成纯化过程，长出白色毛状和深色圆形菌落。浸出液稀释浓度梯度对比发现，稀释10倍的浸出液可优先得到菌落（图1）。

2.2    纯化菌种的鉴定

将马丁氏培养基上生长纯化后的菌落提取高温菌基因组DNA，采用NCBI物种相似度比对进行鉴定。得到短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）、棕黑腐质霉（Humicola fuscoatra），相似度对比分别为99.49%、99.46%。

3    结论与讨论

双孢蘑菇二次培养料主要由木质纤维素成分和嗜热微生物组成，微生物菌群和双孢蘑菇菌丝体共同降解利用培养料中木质纤维素成分，对蘑菇产量和品质起到了关键性作用[2-3]。对嗜热微生物菌落的种类和特征进行研究有助于制作出培养料微生物菌剂或生物表面活性剂，从而改善微生物群落，提高堆肥培养料中纤维素的分解程度，有利于菌丝更好地吸收和利用，达到刺激蘑菇生长或增产的效果，进一步提高双孢蘑菇工厂化周年生产的效益。

本研究从马丁氏培养基平板上得到了嗜热真菌短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）和棕黑腐质霉（Humicola fusc-oatra）单菌落，相似度对比均达99.4%以上。首先，嗜热真菌产生的嗜热酶具有很强的纤维素降解能力，能降解细菌菌体;其次，嗜热真菌在繁殖过程中分泌次级代谢产物，如腐质霉菌会分泌V■，可作为蘑菇菌丝的营养素来源[4]。Wiegant[5]发现，嗜热真菌可以刺激蘑菇菌丝萌发与生长，促进菌丝吃料，从而减少其他杂菌污染，相应地提高了蘑菇产量。

如上所述，嗜热真菌的存在对双孢蘑菇二次培养料发酵的好坏起了决定性作用，可以将这些有益微生物提取出来作为菌剂或生物表面活性剂添加到培养料中来提高蘑菇品质和产量[6]。本研究除了提取出通常报道的嗜热真菌棕黑腐质霉（Humicola fuscoatra）外，还发现了一些不熟悉的嗜热微生物短柄帚霉（Scopulariopsis brevicaulis）等新成员，极大地拓宽了人们对双孢蘑菇二次發酵堆肥这一复杂生境中微生物的认识，也启发了人们要善于利用分子生物学技术来获得一些尚未培养出的微生物类群。

4    参考文献

[1] SCHOCH C L，SEIFERT K A，HUHNDORF S.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer（ITS）region as a universal DNA barcode marker for fungi[J].Proceedings of the National Academy of Science，2012，109（16）：6241.

[2] JURAK E，KABEL M A，GRUPPEN H.Carbohydrates composition of compost during composting and mycelium growth of Agaricus bisporus[J].Carbohydrate，2014，101：281-288.

[3] 高晓静，张昊琳，佟佳兴，等.不同配方双孢蘑菇培养料的细菌群落结构和理化性状[J].应用与环境生物学报，2017，23（3）：502-510.

[4] 杜爱玲，陈立国，杨新美.双孢蘑菇培养料微生物研究概况[J].湖北农业科学，2000（2）：51-53.

[5] WIEGANT W M.Growth characteristics of the thermophilic fungus Scyta-lidium thermophilium in relation to production of mushroom compost[J].Appl Environ Microbiol，1992，58：1301-1307.

[6] 李云福，李正风，董高峰，等.双孢蘑菇培养料发酵过程中细菌群落动态变化[J].菌物研究，2019（2）：94-102.