健脾补肾方对再生障碍性贫血大鼠骨髓造血功能的影响及机制研究

吕丽丽 张琳琳 曹宇峰 王磊 边月平

Email:1035429145@qq.com

【摘要】 目的观察健脾补肾方对再生障碍性贫血(AA)大鼠骨髓造血功能的影响，并从自噬角度探讨其治疗机制。方法40只SPF级 Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组和健脾补肾方组，每组10只。除空白组外，其余3组采用腹腔注射氟尿嘧啶和灌胃马利兰溶解液的方法制作AA大鼠模型。造模成功后，健脾补肾方组灌胃给予健脾补肾方，阳性对照组灌胃给予司坦唑醇混悬液，空白组和模型组灌胃给予等体积0.9%氯化钠溶液。连续给药2周。计数2组外周血细胞和骨髓有核细胞数，并检测2组外周血T淋巴细胞亚群、血清细胞因子、骨髓细胞周期、增殖指数(PI)及自噬、凋亡相关蛋白表达。结果阳性对照组和健脾补肾方组外周血Hb、Ret、WBC、PLT、CD3+、CD4+、Treg细胞比例、CD4+/CD8+、血清IL-11水平、骨髓红系比例、粒系比例、巨核细胞数、骨髓细胞S期和G2/M期细胞比例、PI及LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表达均明显高于模型组，外周血CD8+细胞比例、血清IL-2、TNF-α水平、骨髓淋巴细胞比例、骨髓细胞G0/G1期细胞比例及caspase-3、PARP蛋白表达均明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论健脾补肾方能够促进AA大鼠骨髓造血功能恢复，改善外周血象，并增强机体免疫功能，其机制可能与促进骨髓细胞自噬有关。

【关键词】健脾补肾方；再生障碍性贫血；造血功能

【中图分类号】R 556.5【文献标识码】A【文章编号】1002-7386(2020)05-0714-04

EffectsofJianshenbupiprescriptiononhematopoieticfunctioninratswithaplasticanemiaandrelatedactionmechanisms

LVLili,ZHANGLinlin,CAOYufeng,etal.DepartmentofHematology,TheFirstHospitalofZhangjiakouCity,Hebei,Zhangjiakou075041,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Jianshenbupi prescription on hematopoietic function in rats with aplastic anemia (AA),and to explore its action mechanisms.MethodsA total of 40 Wistar rats (SPF) were randomly divided into four groups:blank control group,model group, positive control group and Jianshenbupi prescription group (observation group),with 10 rats in each group. Except for the rats in blank control group, The rats models with AA were established by giving 5-fluorouracil combined with Maryland by gavage.After successful modeling, the rats in observation group were given Jianshenbupi prescription by gavage,and the rats in positive control group were given stanozolol suspension by gavage, and the rats in blank control group and model group were given the same volume of normal saline,for two weeks. And the peripheral blood cells and bone marrow monouclear cells were counted,and the T cell subsets in peripheral blood, serum cytokines, bone marrow cell cycle, PI and the expression levels of autophagy and apoptosis related proteins were detected.ResultsThe levels of Hb, Ret, WBC, PLT, CD3+, CD4+, Treg, CD4+/CD8+, and the serum levels of IL-11, red cells and megakaryocytes, the proportion of S and G2/M phase cells, PI and the expression levels of LC3-Ⅱ and Bcl-2 proteins in positive control group and observation group were significantly higher than those in model group, however,the levels of CD8+, serum level of IL-2 and TNF-α, the proportion of lymphocytes, the proportion of G0/G1 phase cells and the expression levels of caspase-3 and PARP proteins in positive control group and observation group were significantly lower than those in model group (P<0.05).ConclusionJianshenbupi prescription can improve the hematopoietic function and immune function of rats with AA , and its action mechanism may be related to the promotion of bone marrow autophagy.

【Keywords】 Jianshenbupi prescription; aplastic anemia; hematopoietic function

再生障碍性贫血(AA)是一种临床常见的骨髓造血衰竭性疾病，患者由于造血干细胞质的缺陷或数量减少导致骨髓增生极度减低和外周血全血细胞减少[1-3]。目前，AA的发病机制尚未阐明，但研究发现AA发生发展与免疫失调和细胞因子分泌异常密切相关[4-6]。近年来，自噬在AA、骨髓增生异常综合征(MDS)等血液系统疾病中的作用越来越受到重视。本课题组通过建立AA大鼠模型，观察健脾补肾方对AA大鼠造血功能的影响，并从自噬角度探讨其发挥治疗作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠40只，体重(272.78±30.66)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号：SCXK(京)2012-0001]。

1.2 药品 健脾补肾方组成：黄芪24 g，女贞子15 g，太子参24 g，白术芍15 g，炒丹皮15 g，制半夏10 g，小蓟草15 g，菟丝子24 g，炒枳壳10 g，炙甘草6 g。上述药物加水浸泡1 h，水量加至药材的8倍，煎煮1 h，共2次，合并2次煎煮后水煎液，过滤，浓缩至2 g/ml。阳性对照药物司坦唑醇片购自广西南宁百会药业集团有限公司。

1.3 试剂与仪器 ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。兔抗LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP、β-actin多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司。2000I型全自动动物血液分析仪购自日本希思美康。EPICS XL型流式细胞仪购自美国Beckman公司。Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司。Multiskan FC型酶标仪购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及模型建立：40只大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组和健脾补肾方组，每组10只。除空白组外，其余3组采用腹腔注射氟尿嘧啶(0.15 g/kg)和灌胃马利兰溶解液(0.015 g/kg)的方法制作AA大鼠模型[7]。造模成功后，健脾补肾方组每天按剂量19.2 ml/kg灌胃给予健脾补肾方，阳性对照组每天按剂量4 mg/kg灌胃给予司坦唑醇混悬液，空白组和模型组灌胃给予等体积0.9%氯化钠溶液。连续给药2周。

1.4.2 检测指标及方法

1.4.2.1 外周血细胞计数：10%水合氯醛麻醉大鼠后，股动脉取血，采用全自动动物血液分析仪检测外周血血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)。

1.4.2.2 外周血T淋巴细胞亚群：流式细胞仪检测外周血CD3+、CD4+、CD8+、Treg细胞比例，计算CD4+/CD8+。

1.4.2.3 血清细胞因子：采用ELISA实验测定血清白介素2(IL-2)、白介素11(IL-11)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。

1.4.2.4 骨髓有核细胞数：100倍显微镜下计数骨髓红系、粒系、淋巴细胞比例及巨核细胞数。

1.4.2.5 骨髓有核细胞周期：末次给药后24 h，断颈处死大鼠，取出股骨，PBS冲出骨髓细胞，200目滤网过滤后加入1 ml 4%冰乙酸，2 500 r/min离心30 min，弃上清，1640液冲洗2次，制成单个骨髓细胞悬液，流式细胞仪检测细胞周期，计算细胞增殖指数(PI)。

1.4.2.6 骨髓细胞自噬、凋亡相关蛋白表达：采用Western blot检测骨髓细胞LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP蛋白表达。提取骨髓细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入特异性一抗(1∶5 000稀释)，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，PBS洗膜3次，以GAPDH为内参照基因，ECL反应，采用Image-Pro Plus软件分析目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 4组外周血Hb、RBC、WBC、PLT比较 与空白组比较，模型组外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和健脾补肾方组外周血Hb、RBC、WBC、PLT水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组外周血Hb、RBC、WBC、PLT比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 4组外周血T淋巴细胞亚群比较 与空白组比较，模型组外周血CD3+、CD4+、Treg细胞比例及CD4+/CD8+均明显降低，CD8+细胞比例均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和健脾补肾方组外周血CD3+、CD4+、Treg细胞比例及CD4+/CD8+均明显升高，CD8+细胞比例均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 4组血清细胞因子比较 与空白组比较，模型组血清IL-11水平均明显降低，IL-2、TNF-α水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和健脾补肾方组血清IL-11水平均明显升高，IL-2、TNF-α水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 4组外周血T淋巴细胞亚群比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表3 4组血清细胞因子比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.4 4组骨髓有核细胞数比较 与空白组比较，模型组骨髓红系比例、粒系比例、巨核细胞数均降低，淋巴细胞比例均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和健脾补肾方组骨髓红系比例、粒系比例、巨核细胞数均升高，淋巴细胞比例均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 4组骨髓有核细胞数比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.5 4组骨髓有核细胞周期、PI比较 与空白组比较，模型组骨髓细胞G0/G1期细胞比例均明显升高，S期和G2/M期细胞比例、PI均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和健脾补肾方组G0/G1期细胞比例均明显降低，S期和G2/M期细胞比例、PI均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 4组骨髓有核细胞周期、PI比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.6 4组骨髓细胞自噬、凋亡相关蛋白表达比较 与空白组比较，模型组骨髓细胞LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表达均明显降低，caspase-3、PARP蛋白表达均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组和健脾补肾方组LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表达均明显升高，caspase-3、PARP蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 4组骨髓细胞自噬、凋亡相关蛋白表达比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

AA是由理化因素、病毒感染等多种因素引起的造血干细胞缺陷、造血微环境损伤和免疫失调，从而导致骨髓造血功能障碍，同时造血调控因子分泌异常，骨髓造血干细胞过度凋亡等[8]。中医药治疗AA具有独特优势，能够明显促进骨髓造血功能恢复，并改善机体免疫功能。本研究基于AA“肾虚、血瘀”的病理机制，采用健脾补肾方治疗AA大鼠，观察其对骨髓造血功能的影响，并进一步探讨其治疗机制。

AA主要由于骨髓红系造血干细胞或造血微环境损伤引起，表现为外周全血细胞数量减少和骨髓造血细胞功能障碍。本研究发现，模型组外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平、骨髓红系比例、粒系比例、巨核细胞数均明显低于空白组，淋巴细胞比例均明显高于空白组，说明氟尿嘧啶和灌胃马利兰溶解液联合给药能够显著破坏外周血细胞，抑制骨髓造血功能。而健脾补肾方组和阳性对照组外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平、骨髓红系比例、粒系比例、巨核细胞数均明显高于模型组，淋巴细胞比例均明显低于模型组，提示健脾补肾方对AA大鼠外周血象和骨髓造血功能有显著改善作用。此外，骨髓细胞在周期不同时相的比例是反映细胞增殖和造血功能状况的重要指标之一。本研究中，模型组骨髓细胞G0/G1期细胞比例均明显高于空白组，S期和G2/M期细胞比例、PI均明显低于空白组，表明模型组大鼠骨髓细胞阻滞于G0/G1期，细胞凋亡明显增加，因而骨髓造血功能显著被抑制。而阳性对照组和健脾补肾方组G0/G1期细胞比例均明显低于空白组，S期和G2/M期细胞比例、PI均明显高于空白组，说明健脾补肾方能够解除AA大鼠细胞周期阻滞，促进骨髓细胞增殖，改善骨髓造血功能。

研究表明，免疫异常引起骨髓造血干细胞损伤是AA发生发展的重要病理机制，主要表现为外周血淋巴细胞亚群失调与造血负调控因子分泌增加[9-11]。Treg细胞是一类具有免疫抑制作用的T淋巴细胞亚群，能够抑制T淋巴细胞的活化和增殖及细胞因子的分泌，并对NK细胞和单核巨噬细胞功能发挥调控作用[12]。国内外研究发现，AA患者外周血和骨髓中Treg细胞数量减少和功能损伤，导致其免疫耐受作用降低，从而引起T淋巴细胞过度活化和骨髓造血抑制[13-15]。本研究结果显示，模型组外周血CD3+、CD4+、Treg细胞比例、CD4+/CD8+及血清IL-11水平均明显低于空白组，外周血CD8+及血清IL-2、TNF-α水平均明显高于空白组，提示AA大鼠存在免疫功能紊乱。而阳性对照组和健脾补肾方组外周血CD3+、CD4+、Treg细胞比例、CD4+/CD8+及血清IL-11水平均明显高于模型组，外周血CD8+及血清IL-2、TNF-α水平均明显低于模型组，说明健脾补肾方能够改善AA大鼠免疫功能紊乱，从而减轻其对骨髓造血功能的抑制。

动物实验表明，自噬基因Atg7缺陷的小鼠存在胚胎发育和造血功能障碍[16]。临床研究也发现，AA患者造血干/祖细胞自噬水平较健康人显著降低，且经治疗后随着病情缓解自噬水平逐渐升高[17]。目前认为，自噬缺陷可能引起造血干细胞增殖和分化异常、造血微环境损伤及免疫环境紊乱，进而导致AA发生发展。本研究模型组骨髓细胞LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表达均明显低于空白组，caspase-3、PARP蛋白表达均明显高于空白组，提示AA大鼠存在自噬缺陷。而阳性对照组和健脾补肾方组LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表达均明显高于模型组，caspase-3、PARP蛋白表达均明显低于模型组，说明健脾补肾方可能通过调控自噬抑制骨髓细胞凋亡，这可能是其发挥治疗作用的机制之一。

综上所述，健脾补肾方能够显著改善AA大鼠外周血象和免疫功能紊乱，促进骨髓造血功能恢复，其机制可能与促进骨髓细胞自噬有关。但是，自噬在AA发病中的具体作用机制尚待进一步研究，这对于预防和治疗AA具有重要意义。