N-乙酰半胱氨酸对樱桃谷鸭肠道能量代谢和抗氧化功能的影响

杨书慧，毕云天，程 强，谭灵琳，易 丹，侯永清，郭双双*，丁斌鹰*

（1.武汉轻工大学农副产品蛋白质饲料资源教育部工程研究中心，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是L-半胱氨酸的前体物质，在小肠内能够快速代谢产生谷胱甘肽[1]，并能作为一种巯基来源和抗氧化剂参与机体内与活性氧（ROS）的相互作用，从而减少机体的氧化应激[2]。NAC 也能够影响机体内基因的表达和信号的转导，有保护DNA免受损伤[3]和减轻细胞凋亡的作用[4]。有研究报道，NAC 能够缓解黄曲霉毒素B1对肉鸡生长性能、肾脏损伤和生化指标的不良影响[5]。

单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）作为能量感受器参与调节机体的新陈代谢，AMPK-α1可以催化AMPK 磷酸化，从而调控机体能量代谢和脂质代谢。周华金等[6]研究报道，肉鸡产生热应激时，肝脏AMPK-α1的mRNA 水平与肝脏脂肪代谢的变化趋势一致。低氧诱导因子1（HIF-1α）是调控细胞糖代谢的关键因子。Liu 等[7]研究发现，HIF-1α具有调控机体氧化应激和糖代谢的双重机制。黄嘌呤氧化还原酶（XOR）能够催化多种底物发生氧化反应。Franke 等[8]研究发现，XOR 也能参与脂质的代谢过程。

本实验室前期研究发现，在日粮中添加500 mg/kg NAC 可以改善仔猪小肠的吸收功能[9]并能缓解由脂多糖（LPS）诱导的仔猪肠道黏膜损伤，减轻LPS 对仔猪肠道造成的氧化应激[10]；在肉鸭日粮中添加1 000 mg/kg NAC 显著提高了饲料转化率，添加500、1 000 mg/kg NAC 均能够提高肉鸭肝脏的能量代谢水平和抗氧化功能[11]。目前，NAC 被广泛应用于临床和畜牧业，但在肉鸭上的研究较少。本试验旨在探究NAC 对肉鸭肠道能量代谢和抗氧化水平的影响，为NAC 在肉鸭日粮中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与基础日粮 试验选用90 只健康状况良好的1 日龄樱桃谷鸭，按体重相近、公母对半原则随机分为3 个处理组，每个处理组设置3 个重复，每重复10 只。对照组肉鸭饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加500、1 000 mg/kg NAC。NAC 为市售级医药产品（纯度≥99%）。添加500 mg/kg NAC 和1 000 mg/kg NAC分别增加了日粮中0.0042% 和0.0084% 的氮量，因此不必要在基础日粮中添加非必需氨基酸来平衡3 个处理组日粮中的氮量。试验期21 d。基础日粮参照NRC（1994）肉鸭（1～21 d）的营养需要标准配制，基础日粮组成和营养成分见表1。

1.2 饲养管理 试验前将鸭舍、鸭笼、料槽、饮水器等打扫干净并使用烧碱水消毒，对鸭舍整体进行熏蒸消毒。于试验第7 天接种传染性浆膜炎疫苗（疫苗购自华中农业大学兽医院）。肉鸭采用网上平养方式，自由采食与饮水，24 h 光照，肉鸭1～7 日龄时室温控制在32～35℃，8～14 日龄时室温控制在 24～28℃，15～21 日龄时室温控制在24℃，鸭舍湿度控制在65%～70%。

1.3 样品采集与处理 于试验第22 天每重复随机抽取2 只体重相近的肉鸭，颈部脱臼致死后屠宰取样，取空肠和回肠于预冷的玻璃板上，剖开肠段后用预冷的无RNA 酶水冲洗肠道内容物，用灭菌的载玻片于无菌操作台上刮取肠黏膜，置于无RNA 酶的离心管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存待测。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 空肠和回肠黏膜能量代谢指标 用高效液相色谱法（HPLC）测定空肠和回肠黏膜中的三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的含量。将肠黏膜样品于液氮中研磨成粉末，称取0.1～0.2 g 的肠黏膜粉末置于5 mL 无菌离心管中，然后向离心管内加入2 mL 预冷的高氯酸（c=1.5 mol/L），于冰上机械匀浆后，4℃下3 000 ×g 离心10 min，取1 mL 上清液于新的无菌离心管中，加入0.4 mL碳酸钾溶液（c=2 mol/L），涡旋混匀，4℃下3 000 ×g 离心10 min，收集上清液于1.5 mL的无菌离心管中，用孔径为0.22 μm 的滤膜过滤后上机待测。

色谱条件：高效液相色谱系统为Waters Breezes，由Waters 1 525 高效液相色谱泵、Waters 2 487 紫外吸收检测器和Waters 717 自动进样器组成。色谱柱采用Waters XBridge C18 柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流动相由K2HPO4-KH2PO4磷酸缓冲溶液∶色谱级甲醇（V:V）=77:23 配成，用磷酸调 pH 至 7.0，使用前用 0.22 μm 的滤膜过滤。流动相流速设置为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为20℃；紫外检测器检测波长为260 nm。

根据保留时间确定对应物质，采用洗脱峰面积和标准品浓度计算空肠和回肠黏膜ATP、ADP 和AMP 的含量，结果以μg/g 样品重表示，并计算腺苷池（TAN）和腺苷酸能荷（AEC）的水平。计算公式：

TAN=ATP+ADP+AMP

AEC=（ATP+0.5ADP）/（ATP+ADP+AMP）

1.4.2 空肠和回肠黏膜抗氧化指标 采用南京建成生物技术有限公司试剂盒检测肠黏膜样品中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，以及丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）的含量。检测方法参照试剂盒说明书。

1.4.3 空肠和回肠黏膜AMPK-α1、HIF-1α和XORmRNA水平 采用实时定量PCR 方法检测空肠和回肠黏膜AMPK-α1、HIF-1α和XOR的 mRNA 水平。将肠段样品从-80℃冰箱中取出后，迅速放入液氮中研磨。称取0.1 g 左右的粉末样品，加入装有1 mL RNA 裂解液的无RNA 酶离心管中，充分裂解后，使用TRIzol（TaKaRa，大连）抽提法提取肉鸭空肠和回肠黏膜中的总RNA。采用Nanodrop 2 000 超微量分光光度计检测RNA 浓度，然后用无RNA 酶水将所有RNA 样品稀释至同一浓度，然后使用cDNA 反转录试剂盒进行反转录，最后将合成的cDNA 用于实时荧光定量PCR 的检测。以GADPH和HPRT为内参基因，检测AMPK-α1、HIF-1α和XOR的mRNA 转录水平，相关检测基因的引物序列见表2。

1.5 统计分析 试验数据采用SPSS 21.0 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间差异显著时采用邓肯氏多重比较进行进一步分析。以P＜0.05 为差异显著性标准。试验结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 NAC 对樱桃谷鸭空肠和回肠黏膜能量代谢水平的影响 由表3 可知，与对照组和500 mg/kg NAC 组相比，1 000 mg/kg NAC 组肉鸭空肠黏膜的ATP 含量显著增加。与对照组和1 000 mg/kg NAC 组相比，500 mg/kg组空肠ADP 含量显著降低。与对照组相比，500、1 000 mg/kg NAC 组的空肠AMP 含量、AMP/ATP 和TAN含量均显著降低，但AEC 水平显著提高。与500 mg/kg NAC 组相比，1 000 mg/kg NAC 组的空肠 AMP/ATP 显著降低，但TAN 含量和AEC 水平显著升高。结果表明，2 个剂量的NAC 均增加了空肠黏膜的能量储备，且高剂量的NAC 作用效果更好。

与对照组和1 000 mg/kg NAC 组相比，添加500 mg/kg NAC 显著提高了回肠黏膜的ATP 含量，显著降低了AMP/ATP。与对照组相比，500、1 000 mg/kg NAC 组回肠ADP、AMP 和TAN 含量显著降低。与500 mg/kg NAC 组相比，1 000 mg/kg NAC 组回肠ADP 含量显著降低，AMP 和TAN 含量显著提高。与对照组相比，500 mg/kg NAC 组回肠AEC 水平显著增加，但1 000 mg/kg NAC 组AEC 水平显著降低。结果表明，500 mg/kg NAC增加了回肠黏膜的能量储备。

2.2 NAC 对樱桃谷鸭空肠和回肠抗氧化酶活性及氧化还原状态的影响 由表4 可知，与对照组和500 mg/kg NAC 组相比，添加1 000 mg/kg NAC 显著提高了空肠黏膜中CAT 活性。与对照组相比，500、1 000 mg/kg NAC 组的空肠MDA 和H2O2含量均显著降低。结果表明，2 个剂量的NAC 均提高了空肠黏膜的抗氧化功能，高剂量的NAC 作用效果更好。

与对照组相比，500 mg/kg NAC 组回肠MDA 含量显著增加，1 000 mg/kg NAC 组回肠CAT 活性显著增加，但回肠MDA 含量显著降低。结果表明，低剂量的NAC 对回肠黏膜的抗氧化力有不利影响，但高剂量的NAC 对回肠黏膜具有抗氧化功能。

2.3 NAC 对樱桃谷鸭空肠和回肠黏膜AMPK-α1、HIF-1α和XORmRNA 水平的影响 由图1 可知，与对照组和 1 000 mg/kg NAC 组，500 mg/kg NAC 组空肠黏膜的AMPK-α1mRNA 水平显著下调。与对照组相比，500、1 000 mg/kg NAC 组 空 肠HIF-1α和XOR的mRNA 水平显著降低。结果表明，低剂量的NAC 对空肠能量和抗氧化相关基因的表达具有下调作用，而高剂量的NAC 仅对后者具有下调作用。

表3 NAC 对樱桃谷鸭空肠和回肠黏膜能量代谢水平的影响

表4 NAC 对樱桃谷鸭空肠和回肠抗氧化酶活性及氧化还原状态的影响

图1 NAC 对樱桃谷鸭空肠和回肠黏膜AMPK-α1、HIF-1α 和XOR mRNA 水平的影响

与对照组相比，500、1 000 mg/kg NAC 组回肠HIF-1α的 mRNA 水平显著下调，1 000 mg/kg NAC 组回肠的XORmRNA 水平显著降低。结果表明，2 个剂量的NAC 对回肠抗氧化相关的基因均具有下调作用，高剂量的NAC 作用效果更好。

3 讨 论

本团队前期研究发现，日粮中添加NAC 对樱桃谷肉鸭的平均日增重和平均日采食量均无显著影响，但添加1 000 mg/kg NAC 显著提高了饲料转化率[11]。

AMPK 是真核生物体内的一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是重要的细胞能量感受器。AMPK是细胞能量代谢的关键调控因子之一，当细胞能量降低时AMPK 被激活[12]。一旦激活以后，AMPK 发生磷酸化，继而使细胞中参与ATP 消耗的许多代谢酶失活，细胞中包括脂肪酸和蛋白质合成在内的ATP 消耗过程被抑制，同时ATP 生成的代谢通路被激活，包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸的吸收和氧化[13]。小肠的吸收功能包括许多需要能量供应的物质转运过程，这些过程都依赖于能量代谢[14]。Yi 等[15]研究发现，NAC 对LPS 刺激的仔猪空肠黏膜AMPK 的基因表达没有显著影响，但是NAC通过调控解偶联蛋白2 和ADP/ATP 移位酶1 的基因表达改善了感染仔猪的肠道能量代谢。本研究发现，日粮中添加500 mg/kg NAC 显著降低了空肠黏膜AMPK-α1的mRNA 水平，这种差异可能是由于物种差异。

AMPK 可以通过调节体内糖酵解和脂肪酸等分解途径来维持ATP 的平衡，当AMPK 活性升高时，体内ATP 消耗通路就会被关闭，导致ATP 含量增加或AMP/ATP 降低[16]。本研究中，肉鸭日粮中添加500、1 000 mg/kg NAC 分别对肉鸭回肠和空肠的ATP 浓度和AEC 具有提高作用，对AMP/ATP 具有降低作用，对2 个肠段的AMP 浓度和TAN 都具有抑制作用。细胞内的主要能量供应物质是ATP 和ADP，它们能够通过ATP⇋ADP+Pi 相互转化。ATP 水解过程所释放的能量直接或间接地满足大多数细胞生存的需要[17]。有学者认为，TAN 和AEC 是比AMP 更敏感、更能反映组织能量状态的指标[18]。TAN 反映细胞内总腺苷酸的储备水平、线粒体的氧化呼吸活性以及合成高能磷酸化合物的能力[19]，而AEC 是用腺苷酸存在形式的比率来表示细胞能力状态，它反映了ATP、ADP 和AMP 三者间的高能磷酸键的相互转化情况[20]。当AEC 数值增大表明机体内可供细胞直接利用的高能化合物增多。本试验结果表明，500 mg/kg NAC 提高了空肠和回肠黏膜的能量储备，1 000 mg/kg NAC 只对空肠黏膜的能量代谢具有改善作用。NAC 在机体内的主要吸收部位是小肠，NAC 进入机体后能够代谢参与体内的三羧酸循环和糖代谢[21]。Zhang 等[22]研究表明，NAC 能促进宫内发育迟缓仔猪空肠的ATP 生成，改善空肠抗氧化功能，从而缓解肠道损伤。但是，NAC 对回肠能量代谢的调控作用鲜见报道。

Ju 等[23]研究还发现，激活的AMPK-α1 可以诱导细胞产生ROS，ROS 能够刺激机体细胞产生氧化应激，并且根据氧化应激的持续时间和程度来触发多个信号通路。有研究报道，氧化应激可以上调HIF-1α的mRNA水平[24]。低氧诱导因子-1（HIF-1）是机体在缺氧条件下产生的一种转录因子，它可以减少机体对氧的需求，提高组织细胞对低氧的适应性，HIF-1α是HIF-1的一种亚基，与急性低氧应激有关[25]。HIF-1α上调可以引起细胞炎症，并激活细胞凋亡相关基因的表达[26]。XOR 是一种与ROS 合成相关的酶，是嘌呤代谢的重要组成部分。XOR 含有分子氧的电子受体，当XOR 与分子氧结合时能催化机体产生H2O2和超氧化物自由基。本试验发现，在肉鸭日粮中添加500 mg/kg NAC 下调了空肠AMPK-α1的 mRNA 水平，2 个剂量的 NAC 降低了空肠和回肠HIF-1α和XOR的 mRNA 水平，这说明 NAC 具有减轻空肠和回肠氧化应激的功能。尹鹏等[27]研究发现，在低氧条件下NAC 能够通过下调HIF-1α的表达来抑制肿瘤细胞的增殖。而目前，NAC 对XOR的表达和活性调节的报道还较少。NAC 可能通过下调AMPK-α1、HIF-1α和XOR的 mRNA 水平减少机体 ROS 的产生，减少机体的氧化应激。

SOD、CAT 和GSH-Px 是机体内常见的抗氧化酶，它们的活性强弱间接反映了机体抗氧化应激的能力。MDA 是机体内脂质过氧化反应的终产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。本试验发现，在肉鸭日粮中添加2 个剂量的NAC 均有提高空肠黏膜中GSH-Px 活性的趋势，显著降低了空肠黏膜中MDA 和H2O2含量，添加1 000 mg/kg NAC 显著提高了空肠CAT 活性。这说明NAC 提高了肉鸭空肠的抗氧化酶的活性，减少了机体代谢过程中氧自由基和过氧化反应产物的生成，提高了空肠黏膜的抗氧化能力。本研究团队前期的研究结果表明，500、1 000 mg/kg NAC 提高了肉鸭肝脏的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，降低了MDA 和H2O2水平，显著改善了肝脏的抗氧化功能[11]。在仔猪上的研究表明，NAC 能够降低猪流行性腹泻病毒感染仔猪血浆和空肠H2O2含量，减少感染仔猪的氧化应激[28]。

4 结 论

本研究结果表明，日粮中添加500、1 000 mg/kg NAC 均提高了肉鸭空肠黏膜的能量储备和抗氧化功能，且高剂量的NAC 作用效果更好，两者分别对回肠黏膜的能量代谢和抗氧化力具有改善作用。这些作用可能是通过下调AMPK-α1、HIF-1α和XOR的基因表达实现的。因此，推荐肉鸭日粮中添加1 000 mg/kg 的NAC。