催乳素及其受体在右玉边鸡卵巢中的表达及与就巢性的相关性研究

2020-04-22张俊珍李彩娥苗志强李建慧姬凯元

中国畜牧杂志 2020年4期

张俊珍，李彩娥，张蒙，苗志强，李建慧，姬凯元,3

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学科技处，山西太谷 030801；3.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230000）

边鸡主要分布在山西省右玉县，是在当地特定的生态环境条件下经过长期自然选择和人工选择而形成的一个独特的地方品种，具有蛋重大、肉质好、适应性强、耐粗饲和抗寒等特点，但其就巢性强[1]。家禽就巢与卵泡发育紧密相关，就巢开始时，卵泡发育停止[2-3]。催乳素（Prolactin，PRL）是由单基因编码的多肽类激素，其化学结构与生长激素（Growth Hormone，GH）十分相似，属于生长激素家族[4-5]，可抑制垂体促性腺激素的分泌，使禽类的卵泡发育受到抑制。催乳素受体（Prolactin Receptor，PRLR）作为催乳素靶向调控蛋白，参与了家禽的就巢过程[6]。PRL 和PRLR 相互结合在禽类产蛋和就巢行为中发挥作用。

在家禽产蛋和就巢生物学过程中，卵泡发育是一个以形态变化为特征的生长过程，在此过程中，颗粒细胞因其独特的结构特点及其在卵泡发育中的重要作用而被看作卵泡发育的一个重要标志[7]。卵母细胞和颗粒细胞间形成间隙连接，这种缝隙连接对于二者的交叉对话起重要作用，即颗粒细胞可以调节和影响卵母细胞并促进减数分裂恢复，卵母细胞产生的信号防止颗粒细胞过早分化，以维持颗粒细胞的发育[7-8]。在缝隙连接通讯中，有许多物质从颗粒细胞运输到卵母细胞，从而对卵母细胞起调控等作用，以阶段性地控制从原始卵泡到生长卵泡的发育[9]。高浓度的PRL（1 mg/mL）抑制卵泡颗粒细胞合成孕酮[10]；禽类就巢的起始伴随着PRL 升高，就巢的结束伴随着PRL 降低[11-12]；也有人认为中等含量的PRL 可以维持较高的产蛋水平[13]。PRL 需要通过与靶细胞膜表面的PRLR 进行结合，才能启动相应的细胞内信号转导过程最终实现其生物学过程[14]。关于右玉边鸡PRL 和PRLR 的表达情况与卵泡发育间的关系未见过报道。本研究将对PRL 和PRLR 在右玉边鸡不同发育阶段的卵巢中的表达进行较系统的研究，为家禽优势卵泡选择及提高繁殖性能提供理论依据，为地方优质鸡种的开发与利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料购买右玉边鸡蛋350 枚，进行人工孵化，出壳245 只进行饲养。实验鸡均在相同条件下饲养至330 日龄过程中，分别采集70、165、220、330 日龄各5 只鸡的卵巢组织作为蛋白质提取和免疫组织化学材料，取220 日龄和330 日龄各15 只鸡的血液作为ELISA 的材料。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡卵巢总蛋白的提取取液氮冷冻的鸡卵巢组织，用总蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）提取卵巢组织总蛋白。

1.2.2 免疫组织化学石蜡切片常规梯度酒精脱蜡后。用柠檬酸盐缓冲液高温抗原修复和3%H2O2 阻断内源性过氧化物活性、正常牛血清封闭，37℃孵育30 min。之后，加兔源的PRL 和PRLR（多克隆一抗1:200 稀释），4℃过夜，PSS 洗3 次。然后，滴加二抗（HRP 山羊抗兔IgG），37℃孵育1 h，PBS 洗3 次。DAB 显色液、苏木精染色后，经梯度酒精脱水透明，用中性树胶封片。显微镜观察。PBS 代替一抗作阴性对照。

1.2.3 Western 印迹用RIPA 提取右玉边鸡卵巢组织总蛋白，每孔上样总蛋白为300 μg，SDS PAGE 凝胶电泳后转至NC 膜；经5%脱脂奶粉封闭2 h 后分别加入PRL 和PRLR 兔多克隆抗体（1 000 倍稀释），4℃过夜孵育。次日，TBST 洗膜。加入二抗（HRP 山羊抗兔IgG），室温孵育2 h，TBST 洗膜后加发光液，曝光，压片，观察结果。

鸡卵巢组织总蛋白的PRL 和β-actin 免疫印迹结果用Image-pro plus 6.0 软件（OLYMPUS 公司）对其进行半定量分析，测定印迹条带面积和灰度值，所得数据用SPSS 16.0 软件应用方差分析进行统计学分析。不同样本的光密度用单因子方差分析，分析结果用平均值±标准误表示。

1.2.4 ELISA 检测不同日龄右玉边鸡血清中的PRL 含量采集220 日龄和330 日龄各15 只鸡血液，通过间接ELISA 方法检测鸡血清PRL 含量。用96 孔酶标板包被鸡血清，置于4℃过夜。弃孔内包被液体，加入100 μL封闭液（含3% BSA 的PBS 缓冲溶液）于37℃封闭1 h。弃孔内封闭液，加入100 μL 用PBST 梯度稀释（稀释度从1:100 开始，倍比稀释11 个稀释度）的PRL 一抗，37℃孵育1 h。用PBST 洗液（含5‰ Tween 的PBS 缓冲溶液）洗板5 次。在每孔中加入100 μL HRP 标记山羊抗小鼠IgG 二抗（稀释度为1:50 000），37℃孵育1 h。加入100 μL 显色底物，避光反应5 min，而后在每孔中加入50 μL 终止液终止反应。将96 孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。空白对照为阴性对照。

2 结果

2.1 PRL 在不同日龄鸡卵巢中的分布和表达经过免疫组织化学法染色的卵泡组织切片，PRL 免疫阳性反应物质可见于卵泡腔、基膜、颗粒层细胞、卵泡膜。PRL 在165 日龄的鸡卵巢呈强阳性，尤其是颗粒细胞中。如图1 所示，PRL 在70、220、330 日龄表现为弱免疫阳性，尤其是70 日龄。且220 日龄的免疫阳性弱于330 日龄，70 日龄阳性免疫反应最弱。对照组未出现免疫阳性反应。

Western Blotting 结果显示，鸡卵巢总蛋白中存在能与兔抗PRL 多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带，且分子量大小符合实际大小。对不同日龄的鸡卵巢内PRL 蛋白表达进行定性分析。从图2-A 可以看出，在165 日龄的鸡卵巢中PRL 蛋白水平表达较高，而在70 日龄的鸡卵巢中检测到的信号较弱。图2-B 的半定量分析结果显示，PRL 蛋白在70、165、220、330 日龄的鸡卵巢中的平均蛋白含量差异显著。

图2 PRL 在不同日龄鸡卵巢中的表达水平

2.2 PRLR 在不同日龄卵巢中的表达情况如图3 结果显示，PRLR 的表达水平与边鸡日龄密切相关，在不同的发育阶段均有表达。如图4 显示，蛋白表达量为165日龄＞330 日龄＞220 日龄＞70 日龄（P＜0.05）。

2.3 PRL 在右玉边鸡血清中的含量差异分析如图5 所示，330 日龄的鸡血清中PRL 含量是220 日龄鸡血清中 PRL 含量的 4 倍（P＜0.01）。

3 讨论

图3 PRLR 在不同日龄鸡卵巢中的分布

图4 PRLR 在不同日龄鸡卵巢中的表达水平

图5 PRL 在右玉边鸡血清中的含量差异

禽类的就巢行为是遗传、环境、内分泌等共同作用的结果。家禽中，白来航鸡几乎无就巢性，其他品种均具有不同程度就巢性。禽类就巢机理一般是产蛋期间卵泡分泌大量雌二醇，雌二醇与孕酮相互作用下，下丘脑5-羟色胺（5-HT）和多巴胺（DA）活性增强，并释放血管活性肽（Vasoactive Intestinal Poly-peptide，VIP），VIP 促进垂体前叶分泌PRL，PRL 对启动和维持就巢是关键[15]。Proudman 等[16]利用放射性免疫法研究了火鸡就巢期间和产蛋期间PRL 水平的变化，发现火鸡繁殖期PRL 水平具有显著差异，就巢期间的PRL 水平大约是产蛋期的9 倍。但另一些研究者得出了不同的结论。Reddy 等[17]同样利用放射性免疫法研究了PRL 水平在白来航鸡繁殖期的水平变化，发现产蛋期中PRL一直保持在很高水平，高于火鸡就巢期间PRL 的水平。March 等[18]利用克隆鸡PRL基因表达了PRL 融合蛋白，通过对脚鸡主动免疫融合蛋白，使鸡体内产生了PRL抗体，从根本上抑制了矮脚鸡就巢的发生，在免疫后的一段时间里产蛋性能提高。陈峰等[19]利用VIP 氨基端15 氨基酸残基片段与BSA 偶联产物作为抗原对泰和鸡进行了主动免疫，发现加强免疫后有效抑制了就巢行为的增加，同时使产蛋率重新明显上升，并再次形成一个产蛋高峰。火鸡和鸽子在就巢时，PRL 浓度明显升高来维持正常孵化期[16]。本研究结果表明，PRL 与卵泡发育具有很大的相关性，但是从表达量来看，PRL 在右玉边鸡中起着促进卵泡发育、促进就巢两方面的作用，尤其是进入就巢时，PRL 水平与鸡的产蛋量呈负相关。

大量研究表明，PRL 是维持家禽就巢行为的主要激素，PRLR 参与调控就巢行为的发生和维持。张旭等[20]研究表明，性成熟前籽鹅PRL 和PRLR 的表达量先降低后升高，PRL 对卵巢的反应能力较弱，不会抑制卵巢发育；产蛋期后，尤其是产蛋中、后期，二者的表达量逐渐上升，PRL 与PRLR 特异性结合，引发就巢行为。陈兴勇等[21]采用荧光定量PCR 法对皖西白鹅不同时期卵巢中的PRLR mRNA 的表达研究表明，PRLR 在卵巢组织中高表达量是维持就巢发生的主要因素。汪峰[22]对雪山草鸡不同时期卵巢中的PRL 及PRLR 的研究表明，PRLR 的表达量与产蛋性能呈负相关。沈曼曼[23]对肉鸽不同时期卵巢中的PRLR 的表达水平进行检测发现，卵巢中PRLR 的表达量较高时会抑制卵巢卵泡的发育。本实验发现，PRLR 在右玉边鸡卵巢中随着日龄增长其表达量发生变化，表明右玉边鸡进入产蛋期前，PRLR的表达量虽然逐渐升高，但并不会抑制卵泡发育；右玉边鸡产蛋后期PRLR 的表达量逐渐升高，卵泡发育受到抑制，诱发就巢行为的发生。