电压对微生物诱导生成碳酸钙沉淀的影响

张 彬, 雷学文, 林胜强, 陈彦瑞

(武汉科技大学城市建设学院，武汉 430065)

微生物诱导碳酸钙沉淀(MICP)是一种利用微生物沉淀方解石来改善岩土性质的生物灌浆方法，也是一个复杂的生物化学过程。很多因素：反应物浓度和反应时间，细菌(或者酶)的数量和活性，营养物质的供应，环境条件，还有影响晶体形态的因素都会对其固化效果产生影响。为了确定土壤改良的最佳环境条件，并验证该技术在岩土工程领域的适用性，文献[1-5]对这些因素进行了广泛的研。Qabany 等[6]和Okwadha 等[7]发现不同的细菌浓度、胶结液浓度、环境 pH 和温度都会对脲酶活性产生一定的影响，进而影响到沉积碳酸钙的质量。Cheng 等[8]对比了酸碱度对胶结物含量与强度的影响，结果表明，在碱性条件下，微生物诱导生成的碳酸钙质量最多，中性条件下次之，酸性条件下最少。沈吉云[9]和赵茜[10]通过试验研究发现细菌脲酶活性、尿素浓度、钙离子浓度和 pH 等因素对 MICP 过程有明显影响。陈彦瑞等[11]通过试验发现MICP对玄武岩残积土微生物固化是可行的，反应过程中生成了碳酸钙起到胶结作用，改变了土体的力学性质。

一系列外在因素都会对其固化效果产生影响，电压梯度对碳酸钙的生成量也会带来影响，而碳酸钙的生成量直接影响MICP技术的固化效果，为此，研究不同外加电压、不同通电时间、不同通电方式、不同钙源条件下碳酸钙沉积的影响规律。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用的菌种是从上海嘉楚生物工程有限公司购买的巴氏芽孢杆菌(编号：ATCC11859)冻干粉，采用斜面培养在恒温培养箱内进行活化，

然后从斜面中挑取单菌落溶于液体培养基中，以130 r/min转速在恒温振荡器中进行扩大培养，最后将培养得到的细菌菌液用于甘油管中保存在-70 ℃的超低温冰箱中，采用CASO AGAR+尿素(20 g/L) 培养基，培养基成分如下：胰蛋白胨15 g/L,蛋白胨5 g/L,氯化钠5 g/L,尿素20 g/L,蒸馏水1 000 g/L,琼脂20g/L(配制固体培养基时需添加)，培养基pH调至7.3。采用紫外可见光分光光度计在600 nm波长时的吸光度(OD600)来测定细胞数量，本试验使用OD600来表示细菌浓度，OD600为1.0。

通电过程中的营养液分别由三种钙源(氯化钙、硝酸钙、醋酸钙)与尿素1∶1等体积混合，调pH至7.3，菌液与营养液的体积比为1∶15。钙源为微生物沉积生成碳酸钙提供钙源，尿素为微生物生长提供氮源。

1.2 试验方法

为研究不同电压梯度对巴氏芽孢杆菌诱导碳酸钙生成量的影响，共设置四组电压梯度(0.8、1.0、1.2、1.4 V)以及四个通电时间(10、20、40、80 min)下的3种通电方式(前期通电、后期通电、全程通电)。以通电时长10 min为例，通电试工如下。

前期通电：即先向菌液通电10 min后，吸取1 mL菌液与15 mL缓冲液混合摇匀并静置，静置时间等于通电时间。

后期通电：即菌液前期不通电，直接吸取1 mL菌液与15 mL缓冲液混合摇匀一起通电10 min。

全程通电：即菌液先通电10 min，再吸取1 mL菌液与15 mL缓冲液混合摇匀一起通电10 min。

试验装置如图1所示，学生电源用于提供电压，U形管用于盛装反应液(菌液与缓冲液)，万用表用于随时检测电压情况。试验完成后生成的碳酸钙沉淀使用定量滤纸和漏斗过滤出碳酸钙粉末，然后将U形管与过滤后的滤纸都放入烘箱烘干后称重，最后算出碳酸钙的生成量。

图1 试验装置

2 电压对脲酶活性的影响

为了研究电压对细菌脲酶活性的影响，首先测定了细菌脲酶的电导率随电压梯度在不同时间下的变化特点，取1 mL菌液，与9 mL 1.1 mol/L尿素溶液混合，用电导率仪测量5 min溶液电导率的变化，所测5 min内平均电导率变化值(ms/cm·min)乘以稀释倍数(10倍)，即为菌液酶活性(mmol/L·min)。以电压为横坐标，脲酶活性为纵坐标，绘制电压与脲酶活性关系曲线，如图2所示。

图2 脲酶活性与电压梯度的关系

由图2可知，电压梯度的大小会影响 MICP 的脲酶活性，在不同通电时间条件下，随着电压梯度的增加，脲酶活性均呈现先下降再上升再下降的趋势，并且均在电压为1.2 V时，细菌的脲酶活性最大；而且在相同电压梯度条件下，细菌的脲酶活性均在通电时间为20 min时最大。

3 试验结果与分析

以电压为横坐标，碳酸钙的生成量为纵坐标，绘制氯化钙为钙源时，电压与碳酸钙的生成量关系曲线，如图3所示。

图3 电压对氯化钙为钙源时碳酸钙生成量的影响

由图3可以看出，氯化钙为钙源时，不同的通电时间(10、20、40、80 min)条件下，随着电压梯度的不同，相同通电方式下碳酸钙的生成量均呈现先下降再上升再下降的趋势，在0.8 ～1.0 V时，碳酸钙的生成量随电压的增大而减小，在1.0 ～1.2 V时，碳酸钙的生成量随电压的增大而增大，在1.2 ～1.4 V时，碳酸钙的生成量随电压的增大而减小，但碳酸钙的生成量均在1.2 V达到最大，所以最合适的电压为1.2 V；在相同电压，不同通电时间条件下，可以看出均在通电时间为20 min时碳酸钙的生成量最多，所以最佳的通电时间为20 min。

以电压为横坐标，碳酸钙的生成量为纵坐标，绘制硝酸钙和醋酸钙为钙源时，电压与碳酸钙的生成量关系曲线，如图4、图5所示。

图4 电压对硝酸钙为钙源时碳酸钙生成量的影响

图5 电压对醋酸钙为钙源碳酸钙生成量的影响

由图4、图5可以看出其规律与氯化钙相似，均是在电压为1.2 V，通电时间20 min时碳酸钙的生成量最多。

由于最佳通电时间为20 min，所以以20 min为例，以电压为横坐标，碳酸钙的生成量为纵坐标，绘制出不同钙源不同通电方式下，电压与碳酸钙的生成量关系曲线，如图6所示。

图6 不同钙源不同通电方式碳酸钙生成量与电压的关系

由图6可以看出随着电压梯度的增加，相同的通电时间下，前期、后期、全程均呈现先下降再上升再下降的趋势，但是全程通电碳酸钙的生成量始终高于前期通电和后期通电，所以最佳通电方式为全程通电。

以20 min为例，以电压为横坐标，碳酸钙的生成量为纵坐标，绘制出不同钙源相同通电方式下，电压与碳酸钙的生成量关系曲线，如图7所示。

图7 不同通电方式三种钙源碳酸钙的生成量与电压的关系

由图7均可以看出氯化钙为钙源时，碳酸钙的生成量始终高于硝酸钙和醋酸钙为钙源时的生成量，所以最优钙源为氯化钙。

综上所述，最适电压为1.2 V，最佳通电方式为全程通电，最佳通电时间为20 min，最佳钙源为氯化钙。说明适宜的电压能够促进巴氏芽孢杆菌诱导生成碳酸钙沉淀。产生这种现象的原因是由于适宜的电压能够对巴氏芽孢杆菌的生物活性起促进作用，提高其脲酶活性，进而加速尿素水解加快微生物的成矿作用，最终提高碳酸钙的产量。

4 微细观分析

用金相显微镜观测不同钙源与巴氏芽孢杆菌混合作用后生成碳酸钙沉淀的表面形态，如图8所示。

图8 不同钙源生成碳酸钙沉淀的表面结构

将生成的碳酸钙粉末过滤在滤纸中，将滤纸放在培养皿中，放入电热恒温干燥箱中烘干，烘干后取出适量碳酸钙粉末放在载玻片上用金相显微镜观测其表面结构。

图8(a)是以氯化钙作为钙源，利用巴氏芽孢杆菌诱导生成的碳酸钙沉淀。氯化钙营养盐所生成的碳酸钙沉淀为絮状结构。该结构孔隙大，较为松软。

图8(b)是以硝酸钙作为钙源，利用巴氏芽孢杆菌诱导生成的碳酸钙沉淀。从生成的碳酸钙沉淀可以看出硝酸钙营养盐在巴氏芽孢杆菌诱导下生产的碳酸钙沉淀为石榴状结构。该结构由一个个细小的球形颗粒粘结成，该结构胶结性能较差。

图8(c)是以硝酸钙作为钙源，利用巴氏芽孢杆菌诱导生成的碳酸钙沉淀。从生成的碳酸钙沉淀可以看出醋酸钙营养盐在脲酶菌诱导下生成的碳酸钙沉淀为明显的板状结构伴随有少量颗粒状结构。细小的颗粒状碳酸钙在生成的过程中逐渐凝聚成有一定厚度的板状固体。

因此，后续将针对不同钙源微生物诱导碳酸钙沉淀固化黏性土进行试验，以进一步探究微生物固化对黏性土力学特性影响的内在机理。

5 结论

利用微生物诱导碳酸钙沉淀技术，研究在溶液环境下不同电压梯度、不同通电时间和不同通电方式对于巴氏芽孢杆菌诱导不同钙源产生碳酸钙沉积的影响规律，得到如下结论。

(1)适宜的电压能够对巴氏芽孢杆菌的生物活性起促进作用，提高脲酶活性，而脲酶活性的提高又加快了尿素的水解，从而加快了微生物的成矿作用，最终提高了碳酸钙的产量。

(2)通电方式上对促进巴氏芽孢杆菌生成碳酸钙最有利的是全程通电；最佳通电电压为1.2 V；最优通电时间为20 min。

(3)在相同通电时间，相同通电方式条件下比较三种钙源，发现氯化钙为钙源时，碳酸钙的生成量最多，所以最佳钙源为氯化钙。