液液萃取-场放大进样-毛细管电泳非接触式电导分离检测酱油中的安赛蜜

2020-04-21陈湖水江建坤谢天尧

色谱 2020年6期

陈湖水,江建坤,易佳,谢天尧

(中山大学化学学院, 广东广州 510275)

安赛蜜(acesulfame-K,简称AK糖)是食品中最常见的磺胺类人工合成甜味剂,具有价格低廉和配制方便的特点,因此在食品生产行业有着广泛的应用[1,2]。近年来,人工合成甜味剂的安全性越来越引起人们的重视,长期过量食用磺胺类人工合成甜味剂超标的食品,会对人体的健康造成危害,特别是对代谢排毒能力较弱的老人、孕妇、小孩[3-5]。目前,一些欧盟国家对磺胺类合成甜味剂的使用实行严格的用量限制及在一些特殊的食品中禁止使用磺胺类合成甜味剂。我国食品安全国家标准中规定了各种类型食品中安赛蜜的最大使用量,其中调味品中的最大使用量为0.50 g/kg[6]。酱油作为一种常见的调味品,也普遍存在使用安赛蜜的情况。由于酱油具有十分复杂的基体,微量组分的安赛蜜与大量的无机盐和有机物共存,直接进样分析难以满足测试的要求。因此,建立操作简单、快速灵敏的分离检测新方法尚属于一个具有挑战性的研究课题。

由于安赛蜜在酱油样品中的含量较低,在实际样品测定时存在基体严重干扰问题,需采用对样品进行净化、富集和浓缩的前处理方法。常用的样品前处理技术包括固相萃取法(SPE)和液液萃取法(LLE)。对于检测复杂基体食品样品中安赛蜜的样品前处理方法主要采用SPE法,例如,李健和刘宁[7]以中性氧化铝柱为固相萃取柱,采用HPLC-UV对酱油中糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜3种人工合成甜味剂进行分析检测;徐琴等[8]以分子印迹聚合物微粒为固相萃取吸附剂,结合HPLC-二极管阵列检测器测定了泡菜中的安赛蜜。但对于采用LLE处理酱油样品中安赛蜜则鲜有文献报道。针对不同分析方法,SPE和LLE各有其优势或不足。就本文分析方法而言,采用LLE较SPE有明显优势,避免了SPE处理后需要进一步洗脱的步骤,从而简化了操作过程,节约了分析时间。

目前,安赛蜜的检测方法主要包括分光光度法[9]、离子色谱法[10]、HPLC、HPLC-MS[11-14]和毛细管电泳法(CE)[15,16]。分光光度法需借助化学计量学方法作后续处理,比较复杂;离子色谱法存在重叠峰的问题;HPLC是目前应用最为广泛的一种分析方法,但也存在操作复杂、分析成本高、色谱柱昂贵且容易污染的缺点。CE具有高效、分离速度快、样品和试剂消耗少的特点,是一种环境友好型的分析方法。电容耦合非接触电导检测(C4D)是新发展起来的一种CE检测技术[17],由于C4D中电极不与溶液接触,因而具有良好的适用性、稳定性和重现性。场放大进样(FASI)是一种简单高效的毛细管电泳在线富集方法,富集因子可达数百以上,可以很好地解决常规CE在痕量分析中灵敏度不足的问题[18,19]。近年来,国内外对于FASI-CE-C4D在食品分析方面的应用研究表明,FASI-CE-C4D具有灵敏度高、适用性广、抗干扰能力强和重现性好的优势,适合现场快速检测,是食品分析中行之有效的检测新技术[20-22]。

本文以酱油中安赛蜜的分离检测为研究对象,开发出一种快速高效的液液萃取样品净化处理技术,消除酱油样品中复杂基体对安赛蜜的测定干扰,结合FASI-CE-C4D对其进行灵敏检测。实验对影响萃取效率和CE分离检测的关键因素进行了详细的探讨,包括萃取溶液种类、样品pH值、萃取体积和时间、CE分离和FASI条件等，为市售酱油样品中安赛蜜的快速检测提供了一种灵敏、简单和低成本的检测新方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

CES2008毛细管电泳仪(实验室研制开发)由高压电源、接触式/非接触式双通道电导检测器、毛细管电泳数据工作站等部件组成。石英毛细管柱(45 cm×50 μm,有效长度为40 cm;河北永年光导纤维厂); KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); H1650型电动离心机(湖南湘仪公司); MTN-2800W氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

冰乙酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、盐酸(广州化学试剂厂);安赛蜜标准品(色谱纯,北京国家标准试剂公司)。所用试剂除注明外均为分析纯。水为超纯水,由Millipore超纯水机制备。

用超纯水配制质量浓度为500 mg/L的安赛蜜标准储备液,于4 ℃冰箱储存。实验时,取适量安赛蜜标准储备液，用超纯水配制成不同浓度的标准工作溶液。

用超纯水和冰乙酸直接配制20 mmol/L乙酸溶液作为电泳运行液,现用现配。0.100 mol/L的盐酸溶液经标定后使用(精确至0.001 mol/L)。

1.2 样品前处理

酱油样品(包括海天、李锦记、中邦、凤球麦、东古、一滴香等不同品牌和规格)均采集于中山大学南校区超市。

移取1.0 mL市售酱油样品并准确称重(精确至0.000 1 g),置于100 mL容量瓶中,用超纯水稀释定容至刻度。取0.50 mL上述稀释后的样品,置于5 mL具塞塑料离心管中,加入0.100 mol/L HCl调节pH值至1.7左右(通常加入150 μL经标定的0.100 mol/L HCl即可),摇匀。加入3.0 mL乙酸乙酯,先手动振荡离心管1 min,再于超声池中超声萃取3 min,静置5 min,然后以5 000 r/min离心5 min,静置5 min。取上层有机相500 μL至进样瓶中,于60 ℃氮气流中吹干。吹干溶剂后的残留物用适量超纯水溶解,随后进行FASI-CE-C4D测定。

1.3 分析方法

毛细管在使用前,先将毛细管的两端在超声波清洗器中超声清洗30 s以消除因端口黏附微粒所引起的毛细管堵塞,然后按照以下次序分别冲洗毛细管3 min:超纯水→0.1 mol/L NaOH溶液→超纯水→0.1 mol/L HNO3溶液→超纯水→电泳运行液。实验中,每2次进样分析之间仅需用新鲜的运行液冲洗3 min,基线运行时间为5 min。分析过程运行10次后,需更换新鲜的电泳运行液。分离电压-12 kV,电动进样-11 kV×8 s。非接触式电导检测器输出的信号通过数据工作站采集到微机中进行CE图谱的记录和分析。实验在室温(25 ℃)、相对湿度≤70%的实验条件下进行。

2 结果与讨论

2.1 CE分离条件的选择

选择合适的电泳运行液体系可以获得较高的灵敏度和良好的分离度。安赛蜜在水溶液中以阴离子形式存在,因此采用负高压分离模式,可以获得良好的分离效果。但在负高压模式中,电渗流的方向与阴离子的电泳方向相反,且电渗流的速度常大于阴离子的电泳速度。因此,电泳运行液中常需加入电渗流抑制剂,如十六烷基溴化铵等。本课题组[15]前期已报道发现,采用20 mmol/L乙酸溶液作为电泳运行液(pH=3.2)时,体系的电渗流极小可以忽略不计,因而不需要添加其他的电渗流抑制剂。同时,该体系具有基线平稳、检测灵敏度高的优点。因此,本文采用20 mmol/L乙酸溶液作为电泳运行液,分离电压为-12 kV。

图 1 安赛蜜经(a)常规重力进样(5.0 mg/L)和(b)FASI(0.10 mg/L)的CE-C4D电泳谱图Fig. 1 CE-C4D electropherograms of acesulfame-K by (a) normal hydrodynamic injection (5.0 mg/L) and (b) FASI (0.10 mg/L) C4D: capacitively coupled contactless conductivity detection; FASI: field-amplified sample injection.

2.2 场放大进样在线富集条件的选择

CE在线富集技术中,场放大进样富集具有操作简单、富集效果好的优点。FASI通过样品直接溶于低电导背景值的基质溶液中或是超纯水中就可以简单实现,这是由于毛细管管中充满高电导的背景缓冲溶液,样品溶解于低电导溶液中,在电动进样时,毛细管中的高电导与进样瓶中的低电导之间的差异使得进样端口区间上的电场强度远大于毛细管内的电场强度,从而使样品离子在高电场强度下快速进入毛细管内，并在端口界面上达到富集,从而得到电堆积效果,富集因子可达到100以上,进而使检测灵敏度大幅提高[19]。在场放大进样富集中,需要优化的实验条件主要有:进样介质的组成、进样电压和时间、进样前的水塞(water plug)。同样,在前文[15]中已对FASI的条件作了优化,本文也采用前文的参数:进样介质为超纯水,进样电压为-11 kV,进样时间8 s,重力进样5 s的水塞。在上述的实验条件下,测定了人工合成甜味剂安赛蜜的富集因子,结果表明:通过场放大进样的在线富集技术,安赛蜜的检测灵敏度与按常规进样方法相比,得到显著提高(见图1)。图1a采用的是常规的重力进样,安赛蜜的进样含量是5.0 mg/L;图1b采用的是FASI,进样含量是0.10 mg/L,经计算其富集因子为600。应指出的是,进样前的水塞并非为必需步骤,在满足检测灵敏度的前提下可以省略,从而简化实验步骤。

2.3 前处理条件的优化

对于含人工合成甜味剂安赛蜜的简单基体食品样品(如饮料),可以直接用超纯水稀释至合适浓度后,用FASI-CE-C4D分析测定[15]。但是对于具有复杂基体的酱油样品,其中含有的大量无机盐(如NaCl,含量一般为18%),十分不利于FASI对微量安赛蜜的富集,严重时,会使富集效应消失。这是因为FASI在负高压模式下,样品中大量无机阴离子(如氯离子)与共存的安赛蜜阴离子在FASI过程中存在着竞争,结果使得微量组分的安赛蜜进样量很少,导致安赛蜜的场放大进样富集效果消失殆尽。因此,在FASI-CE-C4D分析前,对于酱油这种复杂基体样品必须进行“净化”处理,以消除样品中共存的大量无机盐的基体干扰,安赛蜜阴离子的进样量在FASI过程中得到显著增强,进而获得很高的检测灵敏度。样品净化处理的内容主要由3个步骤组成:首先,将酱油样品酸化,使以阴离子形式存在于水溶液中的安赛蜜转化为中性分子,以利于转入有机相中;其次,用有机萃取剂对酸化后的样品进行萃取,使安赛蜜完全转移到有机相中,而无机盐等则保留在原溶液中,实现复杂基体的去除;最后,将有机相蒸发除去,用超纯水溶解残留物后,再进行FASI-CE-C4D测定。

以下将对样品净化前处理过程中萃取剂及用量、样品溶液pH值、萃取方式和萃取时间、样品蒸干和再溶解等条件进行讨论。

2.3.1萃取剂及其用量的选择

以空白酱油样品加入2.0 mg/L安赛蜜标准溶液作为测试样品,采用不同的有机萃取溶剂,包括环己烷、乙醚、乙酸乙酯和氯仿,考察其对安赛蜜回收率的影响。结果表明:环己烷几乎不能从水溶液中萃取安赛蜜;采用乙醚和氯仿时回收率低;而乙酸乙酯可以获得满意结果。所以本实验选乙酸乙酯作为萃取溶剂。

实验同时考察了乙酸乙酯的用量(1.0～5.0 mL)对回收率的影响。结果如图2所示,当乙酸乙酯的用量达到3.0 mL时,安赛蜜的回收率可达到95%以上,进一步加大萃取剂的用量,安赛蜜的回收率趋于稳定。因此本实验乙酸乙酯的萃取量选用3.0 mL。

图 2 萃取溶剂用量对安赛蜜回收率的影响(n=5)Fig. 2 Effect of the amount of extraction solution on the recovery of acesulfame-K (n=5)

2.3.2样品溶液pH值的选择

图 3 酱油样品酸化后的pH值对安赛蜜回收率的影响(n=5)Fig. 3 Effect of pH values of soy sauce samples after acidification on the recovery of acesulfame-K (n=5)

安赛蜜以钾盐的形式稳定存在,其pKa值为2.0[15],因此在pH呈中性的水溶液介质中,安赛蜜分子将电离成阴离子存在于样品溶液中。在LLE过程中,存在安赛蜜在水相中的电离平衡,以及安赛蜜在乙酸乙酯有机相与水相之间的分配平衡。在这2个平衡中,分配平衡是主要因素,分配系数愈大则萃取率逾高。电离平衡是次要因素,但会影响萃取率。为了有效地抑制安赛蜜分子的电离,促使安赛蜜阴离子向中性分子转化,从而有利于安赛蜜进入有机相。因此,十分有必要对原始样品进行酸化处理。实验结果表明,样品如果未用盐酸酸化处理,几乎不能萃取安赛蜜;当用盐酸酸化样品溶液的pH值至1.7左右时,安赛蜜的萃取回收率可达95%以上(见图3)。但进一步酸化,pH值<1.3时,回收率开始降低,同时在色谱图中会出现酱油样品中其他同存组分的干扰电泳峰。因此,本实验中样品溶液经盐酸酸化后的pH值设为1.7。

2.3.3萃取方法和萃取时间的选择

实验分别采用手动振荡萃取和超声振荡萃取两种方法对样品进行萃取。结果表明,手动振荡萃取与超声振荡萃取相结合,可以取得更好的萃取效果和更稳定的回收率结果。这是因为手动振荡萃取可以使样品溶液乳化,这样在随后的超声振荡萃取中可以取得更好的萃取效果。因此,本实验采用1 min手动振荡萃取与3 min超声振荡萃取相结合的萃取方式。

2.3.4静置时间和离心时间的选择

超声振荡萃取后,为使含有安赛蜜的有机相与原水溶液相良好分层,需进行静置和离心处理。实验中考察了静置时间和离心时间对测定结果的影响。结果表明:5 min静置时间和5 min的离心处理,可有效降低氯离子在测试溶液中的残留量,故选为实验所用。

图 4 酱油样品经净化处理(a)前、(b)后的FASI-CE-C4D电泳谱图Fig. 4 FASI-CE-C4D electropherograms of the soy sauce sample (a) before and (b) after clean-up procedure

2.3.5有机试剂的去除和残留物再溶解

经萃取和离心后,移取适量上层有机相溶液转移至干净的进样瓶中,在60 ℃的氮气流中将溶剂挥发至干,得到残留物。残留物用适量的超纯水溶解后,进行FASI-CE-C4D进样测定。

样品经上述净化处理后,共存的大量无机盐和有机物基质可以得到较好去除,酱油中的安赛蜜获得了良好的分离检测。图4为含安赛蜜的酱油样品在净化处理前、后的FASI-CE-C4D电泳谱图。由图可知,净化处理前因大量共存的无机盐阴离子(即氯离子)与安赛蜜阴离子在FASI过程中存在着竞争进样,几乎屏蔽了安赛蜜的进样,使得微量组分的安赛蜜进样量很少,结果检测不到安赛蜜的电泳峰。在样品净化处理后,图4a中极大的Cl-峰在图4b中显著降低,干扰物质得到有效去除,少量残留的Cl-已不再干扰安赛蜜的FASI富集效果,安赛蜜得以灵敏检出。

2.4 酱油中其他共存组分的干扰情况

市售酱油中通常会含有一定量的其他食品添加剂,如防腐剂以及风味剂等。因此,实验中着重考察了食品中常见的防腐剂(苯甲酸、山梨酸)、风味剂(柠檬酸、苹果酸)对测定结果的影响。结果未检测到苯甲酸、山梨酸的电泳峰,不干扰实验结果,这是因为苯甲酸、山梨酸具有与电泳运行液乙酸较接近的电离常数值而不能迁移至检测器端,因此未能检出。柠檬酸、苹果酸的干扰在样品净化处理过程中已完全除去,不干扰安赛蜜的测定。

酱油样品相对复杂,即使经LLE处理后,也可能是多种物质共存。由于以下3方面的原因,使得FASI-CE-C4D色谱图并不复杂。①酱油样品中部分组分在LLE处理过程中,保留在水相中而得以除去,未能进入有机相。②在负高压分离模式下,只有阴离子组分才能迁移至检测器中被检出,而阳离子组分则不能被检出。③由于采用的是乙酸电泳运行液,对于那些小于乙酸电离常数值的阴离子,不能迁移至检测器,也不能被检出。那些稍大于乙酸电离常数值的阴离子,电泳峰的出峰时间较长(10 min以上)而落在检测窗口之外。因此其他与安赛蜜一起萃取转移到测试溶液中的少量其他组分并不会全部显现在电泳分离图中。

2.5 方法学评价

用空白酱油样品作为基体,配制安赛蜜标准溶液(0.50～150 mg/kg)。对安赛蜜含量(x, mg/kg)与其峰面积(y)进行线性回归,方程为y=361.51x+26.68,线性相关系数为0.998 1。

在上述选定的实验条件下,对空白加标酱油样品作适当稀释后进行样品前处理和FASI-CE-C4D测定。酱油中安赛蜜的理论含量(x′, mg/kg)与实际测出含量(x, mg/kg)之间呈现良好的线性关系:x=1.012 1x′-0.057 5,线性相关系数为0.999 1。上述线性方程的斜率和线性相关系数接近1,表明方法具有良好的测定准确度。

以目标物的峰高与背景噪声的3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限和定量限,得出酱油样品中安赛蜜的检出限和定量限分别为0.15 mg/kg和0.48 mg/kg。为了进一步消除待测样品中残余的基体干扰,可以采用标准加入法或其他定量方法[18]。本文实验采用标准加入法。

为了考察方法的精密度,进行了日内(intra-day)和日间(inter-day)精密度测定。对含2.0 mg/kg安赛蜜的酱油样品在同一日和不同日平行测定5次,结果表明,日内、日间相对标准偏差(RSD)分别为6.1%和6.6%。表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性,可以满足酱油中安赛蜜的定量分析要求。

图 5 空白酱油样品和加标酱油样品净化处理后的FASI-CE-C4D电泳谱图Fig. 5 FASI-CE-C4D electropherograms of acesulfame-K in the blank and spiked soy sauce samples a. blank sample; b. spiked with 0.80 mg/kg acesulfame-K; c. spiked with 2.0 mg/kg acesulfame-K.

2.6 实际样品测定

为进一步评价本文方法的实际应用价值,将建立的方法用于6个不同品牌和规格酱油样品中安赛蜜含量的测定(见表1)。结果表明,6个酱油样品有3个检测出安赛蜜,含量分别为230、161和189 mg/kg(均在国家标准允许的范围内); 3个酱油样品未检出安赛蜜,与产品的瓶签标注一致。空白酱油样品和加标酱油样品经过样品净化预处理后的FASI-CE-C4D电泳谱图见图5。对实际样品进行加标回收试验,加标水平为2.0 mg/kg,加标回收率为92.3%～108.1%。每个水平进行5次平行试验,相对标准偏差均小于8.0%。