艾灸对去卵巢骨质疏松症大鼠骨髓间充质干细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

姚长风，刘自兵，唐 巍，张 燕，刘存斌，汪宗宝，李斯亮

(安徽中医药大学针灸推拿学院，安徽 合肥 230012)

骨代谢性疾病是临床常见疾病，其中以骨质疏松症的危害性最大。在我国中老年人群中，骨质疏松症女性患者多见。艾灸等中医药疗法是目前临床治疗骨质疏松症的较好方法[1-2]，且不良反应不明显，因而日益受到人们的重视。既往研究[3-4]发现，艾灸关元、三阴交可以有效提高去卵巢大鼠的骨密度，提高血清中雌二醇含量，亦可以有效提高女性患者血清中雌二醇含量，但其内在机制尚未明确。不少学者指出，骨改建的失衡是骨质疏松症发生的根本原因，作为成骨细胞前体细胞的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)在改建过程中具有重要作用。有学者认为，Wnt/β-catenin信号通路是BMMSCs分化为成骨细胞过程中的重要信号通路。因而本研究在既往研究的基础上，以经典的去卵巢大鼠骨质疏松症模型为研究对象，利用现代细胞分子生物学技术，观察艾灸三阴交、关元穴对去卵巢大鼠BMMSCs中Wnt/β-catenin信号通路的影响，探究艾灸影响骨代谢的内在机制。

1 材料

1.1 实验动物 6月龄SPF级SD雌性大鼠60只，体质量(310±10)g，由安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(皖)2011-0002]提供。

1.2 主要试剂及仪器 MTT(BS0328)：北京绿生源科技有限公司；骨钙素(bone glaprotein,BGP)、酶联免疫吸附试验试剂盒(20160110、20160108)：上海源叶生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应仪(PIKOREAL 96)、逆转录试剂盒(00287813)：Thermo；β-连环蛋白(β-catenin)(GR177612-31)：Abcam；TCF-4(7)：CST；一抗Wnt3a(150604)、Dkk1(AF02158945)：Bioss。

2 方法

2.1 动物模型复制、分组和干预 采用随机数字表法将60只大鼠随机分为正常组(20只)和去卵巢组(40只)。在切除大鼠卵巢第13周时，从正常组和去卵巢组各取10只，按照文献[3]方法鉴定骨质疏松症模型。将去卵巢组再随机分成正常组、模型组、雌二醇组和艾灸组，每组10只。实验过程中对动物的处置符合2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

艾灸组大鼠取三阴交、关元穴(参照《实验针灸学》中“大鼠常见穴位图谱”[5]进行穴位定位)，以0.75 cm×30 cm艾条在距穴位皮肤1 cm处进行温和灸，每穴灸15 min，每日1次。雌二醇组给予17β-雌二醇100 μg/(kg·d)灌胃，每日1次。模型组和正常组给予2 mL 9.0 g/L氯化钠注射液灌胃，每日1次。6次为1个疗程，疗程间休息1 d，共12个疗程。

2.2 标本采集 对去卵巢的各组大鼠分别干预12周后处死，在无菌操作下分离股骨和胫骨，剔净周围软组织，剪除两端骨组织，暴露骨髓腔，用2 mL射器，从一端缓慢注入含10%胎牛血清、100 U/mL青-链霉素的高糖ɑ-MEM细胞培养基，将冲出的骨髓细胞，用含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养基置入37 ℃、5% CO2培养箱中培养，2 d换液1次，待用。

2.3 MTT法检测大鼠BMMSCs的活性 取F2代细胞，制成每孔1×103个的细胞悬液，接种到96孔板，设5组，每组3个复孔，每孔细胞悬液200 μL，置37 ℃、5% CO2饱和湿度孵箱内孵育，每间隔4 d取1组，每孔加入MTT(2 mg/mL)20 μL，37 ℃孵育，4 h后吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(分析纯)，移至酶联免疫检测仪上振荡10 min，用分光光度计在492 nm波长处测定每孔的光密度(optical density, OD)，以OD值为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线，培养第4、8、12、16天时，分别检测各组大鼠BMMSCs的相对增长率，以相对增长率反映BMMSCs的活性。

2.4 酶联免疫吸附法检测大鼠BMMSCs中BGP含量 ①收集细胞上清液后，3 000 r/min离心10 min，去除颗粒和聚合物。②设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品50 μL。③样本孔先加入待测样本血清10 μL，再加入样本稀释液40 μL，空白孔不加血清，仅加入稀释液50 μL。④除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。⑤弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次。⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。⑦每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。测定各组大鼠BMMSCs中BGP含量。

2.5 实时荧光定量PCR法测定Wnt3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白-5(low density lipoprotein receptor associated protein-5，LRP-5)、LRP-6、Dkk1、β-catenin和T细胞因子(T-cell factor, TCF) mRNA相对表达水平 将每组F2代BMMSCs移至六孔板内，每孔1×105个，用2 mL含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的ɑ-MEM培养细胞。3 d后，孔内细胞浓度达80%时，吸尽培养液，PBS洗2次，采用一步法抽提mRNA，检验其质量和完整性。逆转录后，采用实时荧光定量PCR法测定Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin和TCF mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。引物由Invitrogen公司合成，每组每个样品设立6个复孔，取均值，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达水平。

表1 Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA的引物序列

2.6 Western blot法测定Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白的表达水平 按“2.5”项下方法培养BMMSCs，加入100 μL蛋白裂解液[V(PMSF)∶V(RIPA)=1∶100]，冰上静止20 min，收集裂解的细胞，12 000 r/min离心15 min，收集上清后，采用Western blot法测定Wnt3a、Dkk1、β-catenin和TCF蛋白的表达水平。

3 结果

3.1 不同时点4组大鼠BMMSCs活性比较 随着培养时间延长，除了模型组外，其他3组大鼠BMMSCs相对增长率显著升高，各时点差异均有统计学意义(P<0.05)。在培养第4、8、12、16天，模型组大鼠BMMSCs相对增长率均显著低于正常组(P<0.05)，雌二醇组大鼠BMMSCs相对增长率均显著高于模型组和艾灸组(P<0.05)；在培养第12、16天，艾灸组大鼠BMMSCs相对增长率显著高于模型组(P<0.05)。见图1。

注：与正常组比较，*P#P△PaPbPcP

3.2 4组大鼠BMMSCs中BGP含量比较 模型组大鼠BMMSCs中BGP含量显著低于正常组(P<0.05)，雌二醇组和艾灸组大鼠BMMSCs中BGP含量显著高于模型组(P<0.05)。见图2。

注：与正常组比较，*P#P<0.05

3.3 4组大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA相对表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相对表达水平均显著下调(P<0.05)，Dkk1 mRNA相对表达水平显著上调(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相对表达水平均显著上调(P<0.05)，Dkk1 mRNA相对表达水平显著下调(P<0.05)；与雌二醇组比较，艾灸组Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相对表达水平均显著下调(P<0.05)，Dkk1 mRNA相对表达水平显著上调(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与雌二醇组比较，△P<0.05

3.4 4组大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相对表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠BMMSCs中Wnt3a、β-catenin、TCF蛋白的相对表达水平显著下调，Dkk1蛋白的相对表达水平显著上调，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，艾灸组和雌二醇组Wnt3a、β-catenin、TCF蛋白的相对表达水平显著上调，Dkk1蛋白的相对表达水平显著下调，差异均有统计学意义(P<0.05)；与雌二醇组比较，艾灸组Wnt3a、β-catenin蛋白的相对表达水平显著下调(P<0.05)，TCF蛋白的相对表达水平下调(P>0.05)，Dkk1蛋白的相对表达水平显著上调(P<0.05)。见图3、表3。

4 讨论

近年来的研究表明，BMMSCs在骨折愈合、骨质疏松症的治疗中发挥了重要的作用[6-7]。黄建华等[8]认为肾中所藏的先天之精主要相应于机体的胚胎干细胞及其他存在于各种人体组织器官中的成体干细胞，通常情况下，这些体内的干细胞是处于正常休眠的状态，当受到外界刺激时，可激活、分化成机体各组织器官内在环境中所需要的细胞[9-10]。本次研究发现，艾灸三阴交、关元穴可增强BMMSCs的活性，使BGP水平升高。我们的既往研究也发现，针灸此两穴可调节雌激素水平，增强骨密度[4,11]。

图3 Western blot法检测的4组大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相对表达水平

表3 4组大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相对表达水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与雌二醇组比较，△P<0.05

结合本研究结果，说明骨密度的增加可能与针灸后BMMSCs的成骨分化作用增加有关。本研究选用的艾灸穴为关元、三阴交，均居治疗骨质疏松症常用穴位的前10位[12]，分属任脉和脾经，具有健脾益气、调肝补肾作用[13]和强身健体、补肾壮阳、调理冲任、理气和血作用[14]。更有研究者证实艾灸可提高骨密度[15]。因艾灸时可“以之艾火，透诸经而除百病”(《本草从新》)，与中医药的其他治疗方法一样，其可通过艾灸特定的经穴，达到一定的临床效应。

艾灸关元、三阴交穴提高骨密度的内在机制可能与其干预大鼠BMMSCs的Wnt/β-catenin信号通路有关。Wnt/β-catenin通路是Wnt信号转导通路中的一条经典通路，也是与骨代谢关系密切的一个重要信号通路。当其激活时，Wnt3与跨膜蛋白LRP-5/6以及卷曲蛋白受体结合，抑制糖原合成酶激酶-3β磷酸化β-catenin，使β-catenin在细胞内蓄积。本研究发现，艾灸组相较于模型组，其大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin mRNA的表达均上调，且Wnt3a、β-catenin蛋白的表达水平亦升高。结果提示通过艾灸关元、三阴交穴可能激活BMMSCs的Wnt/β-catenin信号通路，阻止GSK3β对β-catenin的降解，使胞质内β-catenin蓄积，转入细胞核内，与TCF/淋巴样增强子1结合，调节靶基因的转录[16],从而促使BMMSCs向成骨细胞分化加强[17]。本研究也证实，在此信号激活转导过程中细胞核内TCF mRNA及其蛋白的表达均明显上调。

Wnt/β-catenin信号转导通路中还有一些重要的负向调节因子[18]。Dkk1是常见的3个负向调节因子之一，是一种分泌性糖蛋白，研究发现Dkk1能与LRP5/6、跨膜受体Kremen 1/2结合形成三聚体，诱导细胞内吞，减少LRP5/6在细胞膜上的表达，从而阻断Wnt信号继续向胞内传递[19]。有学者认为，Dkk1在骨形成过程中起着重要作用，是骨质疏松、骨修复的治疗靶点[20]。本研究发现，艾灸关元穴、三阴交穴后，相较于模型组，雌二醇组和艾灸组大鼠BMMSCs的Dkk1 mRNA和蛋白表达皆下调。因此，我们推测在该信号通路转导过程中，艾灸关元、三阴交穴可能抑制了Dkk1 mRNA及其蛋白的表达，促使Wnt更易于与LRP5/6蛋白结合，从而激活Wnt信号通路，增强BMMSCs的成骨分化功能，有助于骨形成。许多研究也表明，阻断Dkk1的功能有利于骨形成和防止系统性骨量丢失[21]。

本研究结果提示，艾灸关元、三阴交可以增强大鼠BMMSCs的活性，提高BGP水平，激活Wnt/β-catenin信号转导通路，抑制通路中负向调节因子Dkk1的表达，从而使BMMSCs的成骨分化功能增强，恢复骨代谢平衡。本研究揭示了艾灸防治骨质疏松症的内在机制，有助于寻找新的、有效的，能够代替激素治疗骨质疏松症的方法。下一步将观察艾灸频次、艾灸量和艾灸时间对骨质疏松症的影响，进一步探究艾灸激活Wnt/β-catenin信号转导通路中“决定性”的信号靶点。