不同条件对枯草芽孢杆菌菌剂有效活菌数的影响

孙 洁 刘菊莲 王磊刚 胡登吉

（宁夏顺宝现代农业股份有限公司 宁夏·青铜峡 751600）

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种好氧菌，属于革兰氏阳性菌，具有良好的耐酸碱、耐高温等特性。枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用，在极端的条件下，可以诱导产生抗逆性很强的内源性孢子[1]。枯草芽孢杆菌具有孢子休眠期、生殖生长期两个生长时期，会在生长环境恶劣、营养物质缺乏等不适宜的环境下进入孢子休眠期，并形成具有极强抗逆作用，在高温、酸碱等极性环境下亦可生存的芽孢，从而适应环境得以生存，一旦环境变得适宜生长、营养充足，芽孢会自动进入生殖生长期，芽孢重新生长为枯草芽孢杆菌[2]。

枯草芽孢杆菌可作为生物农药投入到植物病害应用中，可以防治作物多种真菌病害[3]。能够提高农作物抗病能力，尤其能防治根瘤病、寄生虫、土壤线虫病等，为细菌繁殖抑制菌提供生长环境，使病菌、虫卵在土壤中自然地被除掉[4]。具有一定的固氮、解磷、解钾作用，可以促使土壤中的有机质分解成腐殖质，刺激作物生长，平衡土壤pH值，调节植物根系生态环境，形成优势菌落，防止土传病虫害，解除化肥、农药及有害因子对土壤的破坏，克服连作障碍[5]。

通过对枯草芽孢杆菌进行不同条件的处理，探究影响枯草芽孢杆菌有效活菌数的因素，为微生物菌剂和生物有机肥产品的生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌（宁夏顺宝现代农业股份有限公司研发）、巨大芽孢杆菌（外购产品）、营养琼脂（北京奥博星生物技术有限公司）、5%NaOH水溶液、5%HCl水溶液等。

pH计、温度计、恒温水浴锅、Φ90mm玻璃培养、立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS）、恒温摇床（HNY-2102C）、恒温培养箱（MHP-100）、净化工作台（JJ-CJ-2FD）等。

1.2 方法

1.2.1 灭菌水的制备：将去离子水加入1000ml三角瓶中，塞上棉花塞，用报纸包好瓶口，121℃灭菌20min，取出后冷却备用。

1.2.2 不同pH枯草芽孢杆菌菌液的配制：分别称取1.0g枯草芽孢杆菌菌剂加入100ml灭菌水中，加入少量灭菌的玻璃珠，用5%NaOH、5%HCl溶液将菌液 pH 分别调节至 3、5、7、9、11 五个梯度，摇匀后室温下保存。每7日测定一次有效活菌数。

1.2.3 不同温度处理的枯草芽孢杆菌菌液的配制：分别称取1.0g枯草芽孢杆菌菌剂加入100ml灭菌水中，加入少量灭菌的玻璃珠摇匀，设置20℃、30℃、40℃、50℃、60℃五个温度梯度。将菌液置于水浴中缓慢加热，加热至目标温度时立即从水浴中取出，自然冷却。室温下静置过夜后测定其有效活菌数。

1.2.4 培养基平板制备方法：称取33.0g营养琼脂，加入1000ml去离子水中，加热搅拌溶解后分装，于121℃灭菌20min，取出冷却至60℃左右。将培养基倒入φ90mm的培养皿中，厚度约为3～5mm，冷却凝固后备用。

1.2.5 有效活菌数的测定方法：取10ml均匀菌液加入灭菌后带玻璃珠、具棉塞的500ml三角瓶中，加入90ml灭菌水，在旋转式摇床上200r/min充分震荡30min，即得基础母液。用无菌刻度吸管吸取5.0ml上述母液，加入45ml无菌水，按1∶10进行系列稀释，分别得到 1∶1×101、1∶1×102、1∶1×103、1∶1×104……稀释的菌悬液。

每个样品取三个连续的稀释度，分别取不同稀释度的菌悬液0.1ml，加到预先制备好的培养基平板上，分别用无菌涂布器涂布均匀。每个稀释度重复3次，并以无菌水做空白对照。于37℃培养过夜，第二天以出现20～300个菌落数的平板为计数标准，统计有效活菌数目。当只有一个稀释度，其平均菌落数在20～300个之间时，则以该稀释度平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20～300个之间时，应按两个稀释度菌落总数之比值决定。若其比值≤2，则应计算两者的平均数，若比值≥2则以稀释度小的菌落平均数计算[6]。

式中：

nv—体积有效活菌数，单位为亿每毫升（亿/ml）；

X—菌落平均数，单位为个；

k—稀释倍数；

V1—基础液体积，单位为毫升（ml）；

V2—菌液加入量，单位为毫升（ml）；

V0—样品量，单位为毫升（ml）。

1.2.6 枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的拮抗实验：用打孔器取滤纸片，装入玻璃瓶中，121℃灭菌20min，取出后烘干并冷却。称取0.1g枯草芽孢杆菌，加入100ml灭菌水中，摇匀，称取0.1g巨大芽孢杆菌，摇匀后加入100ml灭菌水中，加入灭菌的滤纸片浸泡30min。取0.1ml均匀的枯草芽孢杆菌加入营养琼脂培养基平板上，用无菌涂布器涂布均匀，取浸泡了巨大芽孢杆菌菌液的滤纸片，挥干水分，贴于培养基平板上，4℃扩散1h，于37℃倒置培养过夜。

1.3 数据与分析

运用MicrosoftExcel应用程序进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同pH条件对枯草芽孢杆菌有效活菌数的影响

表1 不同pH条件对枯草芽孢杆菌有效活菌数的影响（亿/ml）Table.1 Effect of different pH conditions on colony-forming unit of bacillus subtilis（108CFU/ml）

由表1可以看出，pH为5时菌液中枯草芽孢杆菌含量最高，pH为3时次之，pH7、pH9低于pH3，pH为11时菌液中枯草芽孢杆菌含量最低。随着时间的推移，pH为3、5、7、9的菌液中枯草芽孢杆菌的数量先增加，达到一定的数量后开始下降；pH为11的菌液中枯草芽孢杆菌数量先增加，达到一定数量后开始连续下降。第一天测定的有效活菌数 pH5＞pH3＞pH7＞pH9＞pH11，菌液中的枯草芽孢杆菌有效活菌数开始增长，在第14天测定时数量达到峰值，其中 pH5＞pH7＞pH3＞pH9＞pH11，之后逐渐下降并趋于稳定，28 天测定的有效活菌数 pH5＞pH7＞pH3＞pH9＞pH11，但 pH 为11时其菌液中枯草芽孢杆菌数量下降幅度较大。这说明本品种枯草芽孢杆菌在pH为3～7的条件下生长旺盛，在pH为5时有效活菌数最高。

2.2 不同温度条件对枯草芽孢杆菌有效活菌数的影响

表2 不同温度条件对枯草芽孢杆菌有效活菌数的影响Table.2 Effect of different temperature conditions on colony-forming unitof bacillus subtilis

由表 2可见，其有效活菌数20℃＞30℃＞40℃＞50℃＞60℃，随着温度的上升，有效活菌数逐渐降低，当温度在20～40℃之间时，枯草芽孢杆菌存活率＞90%，当温度达到60℃时，枯草芽孢杆菌存活率仅为66.67%。这说明在20～40℃范围内本试验所使用的枯草芽孢杆菌可以保持90%以上的活性。

2.3 枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌之间的拮抗作用

由图1可见，培养基平板上的滤纸片周围产生了抑菌圈，抑菌圈平均直径为17.6cm，本试验所用的枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌之间会产生拮抗作用，故在产品复配时，两种菌剂不能掺混，否则会有抑制作用。

3 结论与讨论

不同pH和温度条件会对枯草芽孢杆菌产生较为明显的作用。本研究表明，pH在3～7时枯草芽孢杆菌生长相对旺盛，其中pH为5时有效活菌数最高，这与杨峰等[6]枯草芽孢杆菌在弱酸性和中性环境中生长旺盛的结论较为接近；当温度在20～40℃时，本试验所使用的枯草芽孢杆菌存活率达到90%以上。另外，通过研究表明，本实验所使用的枯草芽孢杆菌会和巨大芽孢杆菌产生拮抗作用，故二者不适合掺混。

综上所述，本试验所用枯草芽孢杆菌适宜生长的pH条件为3～5，适宜生长的温度为20～40℃，同时与巨大芽孢杆菌存在拮抗作用。这对后期研发生物有机肥、复合生物有机肥及复合生物菌剂提供了一定的参考依据。