全反式维甲酸在宫腔粘连模型中抗子宫内膜纤维化作用及机制研究

李玉华 李萍 韩立薇 曾晓琴 李艳秋 冯苗 张碧云

（1 广东省计划生育科学技术研究所 广东 广州 510600）

（2 广州市妇女儿童中心 广东 广州 510000）

子宫承担着胎儿孕妇的重要职责，对女性具有重要意义。女性达到育龄期之后，子宫内膜功能层在雌孕激素的作用下发生无瘢痕修复，但基底层子宫内膜容易在感染及创伤的作用下，发生纤维化改变引起宫腔粘连（IUA）[1]。全反式维甲酸（ATRA）属于维生素A 的衍生物，研究发现，其抗纤维化作用较强，目前，关于ATRA 应用于宫腔粘连的相关报道较少，本研究主要通过观察ATRA在宫腔粘连模型中的预防及治疗效果，探讨全反式维甲酸在宫腔粘连宫内膜纤维化作用及机制，以提高IUA 治疗的临床疗效[2-3]。

1.资料与方法

1.1 临床资料

选择2019 年1—12 月在我院妇科及广州市妇女儿童中心妇科行子宫切除术及宫腹腔镜联合术行诊断性刮宫（排除子宫内膜病变）的术后子宫内膜，作为研究，分为对照组，（正常对照组、模型对照组）以及观察组（低浓度观察组、中浓度观察组、高浓度观察组），进行体外实验。除此之外，选择新西兰大白兔，雌性，体重2 ～3.5kg，分为正常对照组，宫腔粘连模型组，观察组（全反式维甲酸低剂量组、中剂量组、高剂量组）进行全反式维甲酸对宫腔粘连作用的机制进行研究。

1.2 方法

取患者子宫内膜组织，清洗之后放入灭菌离心管中，采用2%I 型胶原酶进行消化积过滤，并利用PBS 液洗涤细胞，离心后弃上清重悬细胞并计数，对细胞密度进行调整，移至细胞培养瓶中，置培养箱中。及时更换培养液，进行传代培养，选择第三代宫内膜基质细胞（ESCs）。

对照组：正常对照组ESCs，不使用药物进行干预。模型对照组采用10ng/mlTGF-β1 对ESCs 进行作用，时间为48h。

观察组：低浓度观察组采用10ng/mlTAF-β1 对ESCs 进行作用48h 后，再加入ATRA0.01uM，继续作用48h。中浓度观察组的方法同低浓度观察组，加入的ATRA 的剂量为0.1uM。高浓度观察组方法同低浓度观察组，ATRA 记入剂量为1uM。

分别对新西兰兔腹腔注射低、中、高浓度ATRA 完成建模，通过HE 染色法对子宫内膜腺体数量进行统计，对转化生长因子-β（TGF-β1）、癌基因smad4、α1-1 型胶原基因（COL1A1）、I 型胶原α2（COL1A2mRNA）表达进行检测。

1.3 观察指标

（1）ATRA 对三组基质细胞指标的影响；（2）子宫内膜腺体计数比较；（3）ATRA 对三组TGF-β1、smad4、COL1A1、COL1A2mRNA 表达影响比较

1.5 统计分析

采用SPSS18.0 软件处理，计量资料行F检验，采用（±s）表示，P＜0.05 差异有统计学意义。

2.结果

2.1 ATRA 对三组基质细胞指标的影响比较

经过对比发现，模型对照组COL1A1、成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMAmRNA）水平显著高于正常对照组（P＜0.05），全反式维甲酸观察组中各项指标相较于模型对照组明显减少（P＜0.05），且COL1A1mRNA 表达量随浓度增加，呈递减趋势，α-SMAmRNA 随浓度的增加，表达量呈递增趋势（P＜0.05），见表1。

表1 ATRA 对三组基质细胞指标的影响比较表（±s）

表1 ATRA 对三组基质细胞指标的影响比较表（±s）

注：与正常对照组比较，eP ＜0.05，与模型对照组比较，fP ＜0.05。

组别 COL1A1 α-SMA正常对照组 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 1.96±0.04e 1.62±0.17e低剂量组 1.74±0.06f 1.46±0.08f中剂量组 1.54±0.04f 1.38±0.06f高剂量组 1.35±0.02f 1.22±0.08f F 5.961 7.943 P 0.001 0.002

2.2 三组子宫内膜腺体计数比较

结果表明，正常对照组内膜腺体个数较多，宫腔粘连模型组内膜腺体个数明显少于正常对照组，观察组腺体计数有所增加，其中，高剂量观察组增加幅度较大（P＜0.05），见表2。

表2 三组子宫内膜腺体计数比较（±s）

表2 三组子宫内膜腺体计数比较（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.05，与宫腔粘连模型组比较，#P ＜0.05。

分组 时间造模后7d 造模后14d正常对照组 13.34±1.72 14.35±2.17宫腔粘连模型组 3.41±0.75* 3.63±1.26*低剂量观察组 6.68±0.84*# 7.65±1.53*#中剂量观察组 9.96±0.62*# 9.95±1.48*#高剂量观察组 11.51±1.08*# 11.12±1.01*#F 6.326 8.135 P 0.001 0.001

2.3 ATRA 对三组TGF-β1、smad4、COL1A1、COL1A2mRNA 表达影响比较

结果表明，宫腔粘连模型组个水平表达显著高于正常对照组，观察组各组指标较宫腔粘连模型组明显降低（P＜0.05），TGF-β1、smad4、COL1A1 随药物剂量增加呈递增趋势，COL1A2mRNA 表达量随剂量降低而增加（P＜0.05），见表3。

表3 ATRA 对三组TGF-β1、smad4、COL1A1、COL1A2mRNA 表达影响比较（±s）

表3 ATRA 对三组TGF-β1、smad4、COL1A1、COL1A2mRNA 表达影响比较（±s）

注：同正常对照组比较，aP ＜0.05，与模型组比较，bP ＜0.05，cP ＜0.05。

组别 TGF-β1 Smad4 COL1A1 COL1A2正常对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00宫腔粘连模型组 5.51±0.22a 4.58±0.25a 6.75±0.18a 6.62±0.14a早期治疗组 4.24±0.18b 3.68±0.15b 5.43±0.16b 5.24±0.12b晚期治疗组 5.46±0.11c 4.27±0.18c 6.76±0.22c 4.79±0.17c F 5.693 7.184 9.367 8.942 P 0.001 0.001 0.002 0.001

3.讨论

子宫内膜分为基底层与功能层，功能层存在周期性增生、剥落，形成女性月经。子宫内膜细胞包括上皮细胞及内膜机质细胞两种，子宫内膜基质细胞能够使子宫内膜、腺上皮及腺体的结够保持正常[4-5]。肌成纤维细胞在人体中的分布较为广泛，常出现在组织修复过程中，并随修复完成而消失，当器官出现纤维化，集成纤维季报较为活跃，破坏器官正常结构，在器官纤维化的过程中，起到了重要作用[6-7]。在本研究中，通过TGF-β1对ESCs 进行作用，模型对照组COL1A1、α-SMAmRNA 水平显著高于正常对照组（P＜0.05），全反式维甲酸观察组中各项指标相较于模型对照组明显减少（P＜0.05），且COL1A1mRNA 表达量岁浓度增加，呈递减趋势，α-SMAmRNA 随浓度的增加，表达量呈递增趋势（P＜0.05），说明，全反式维甲酸对子宫内膜纤维化具有重要作用[8-9]。妊娠后刮宫容易造成宫腔粘连的产生，其对子宫内膜基底层造成损害，促进了TGF-β1、IGF-I 的分泌，造成子宫内膜修复延迟，从而引起宫腔膜性、肌性结缔组织粘连[10]。我们通过对模型进行自摸内膜机械损伤，采用免疫组化监测TGF-β1 的表达发现，结果表明，正常对照组内膜腺体个数较多，宫腔粘连模型组内膜腺体个数明显少于正常对照组，观察组腺体计数有所增加，其中，高剂量观察组增加幅度较大（P＜0.05），说明，全反式维甲酸能够下调TGF-β1，从而达到预防宫腔粘连的目的，加快子宫内膜修复。宫腔粘连的发展程度，对治疗结果及预后效果具有直接影响，通过不同治疗时间段对TGF-β1、smad4 等表达水平践行观察发现，其在宫腔粘连早期治疗效果明显，在晚期阶段，对子宫内膜纤维化作用并不明显[11-12]。在本研究中，结果表明，宫腔粘连模型组个水平表达显著高于正常对照组，观察组各组指标较宫腔粘连模型组明显降低（P＜0.05），TGF-β1、smad4、COL1A1 随药物剂量增加呈递增趋势，COL1A2mRNA 表达量随剂量降低而增加（P＜0.05），说明，ATRA 在宫腔粘连能够在宫腔粘连减轻子宫内膜纤维化。

综上所述，全反式维甲酸能够抑制子宫内膜基质细胞向肌成纤维细胞的转化，对细胞胶原COL1A1 生成具有阻碍作用，从而控组子宫内膜纤维化的形成，值得推广应用。