马钱苷对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响及机制研究

张聪 胡娜 李珊 郑国华 邱振鹏

摘 要 目的：研究馬钱苷对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法：运用CCK-8法检测不同质量浓度（10、25、50、100、150、200、300、400 ?g/mL）的马钱苷作用24、48 h对HepG2细胞增殖活性的影响。将HepG2细胞分为对照组和马钱苷低、中、高浓度组（50、100、150 μg/mL），加药作用24 h后，采用Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡形态学变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布情况;采用Western blotting法检测各组细胞中G1/S-特异性周期蛋白D1（Cyclin D1）、增殖细胞核抗原（PCNA）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、活化的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9蛋白的表达水平。结果：马钱苷对HepG2细胞增殖具有抑制作用，且呈浓度依赖趋势。与对照组比较，马钱苷低、中、高浓度组细胞出现核固缩、碎裂等凋亡现象，细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;细胞主要阻滞于S期;马钱苷低、中、高浓度组细胞中Cyclin D1、PCNA、Caspase-3蛋白的相对表达量均显著降低、Cleaved-Caspase-3蛋白的相对表达量均显著升高（P<0.05或P<0.01），马钱苷中、高浓度组细胞中Cleaved-Caspase-9蛋白的相对表达量均显著升高、Bcl-2和Caspase-9蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结论：马钱苷对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可诱导其凋亡，其作用机制可能与抑制Bcl-2蛋白表达，促进Caspase-3、Caspase-9活化有关。

关键词 马钱苷;肝癌细胞HepG2;增殖;凋亡;机制

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of loganin on the proliferation and apoptosis of liver cancer HepG2 cells， and to explore its mechanism. METHODS： CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations （10， 25， 50， 100， 150， 200， 300， 400 ?g/mL） of loganin on the proliferation activity of HepG2 cells for 24 and 48 h. HepG2 cells were divided into control group， loganin low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （50， 100， 150 μg/mL）. After treated for 24 h， morphological changes of apoptosis of cells were detected by Hoechst 33342 fluorescence staining. The apoptosis and cycle distribution of cells were detected by flow cytometry. Western blotting was used to detect protein expression of Cyclin D1， PCNA， Bcl-2， Caspase-3， Cleaved-Caspase-3， Caspase-9 and Cleaved-Caspase-9. RESULTS： Loganin inhibited the proliferation of HepG2 cells， in concentration-dependent trend. Compared with control group， apoptosis as pyknosis and fragmentation occurred， and the apoptosis rate increased significantly in loganin low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （P<0.01）; the cell were mainly blocked in S phase; relative protein expression of Cyclin D1， PCNA and Caspase-3 were significantly decreased， while that of Cleaved-Caspase-3 were significantly increased in loganin low- concentration， medium-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）; relative protein expression of Cleaved-Caspase-9 were increased significantly， while that of Bcl-2 and Caspase-9 were decreased significantly in loganin medium-concentration and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Loganin can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells， the mechanism of which may be associated with inhibiting Bcl-2 protein expression and promoting Caspase-3， Caspase-9 activation.

KEYWORDS   Loganin; Liver cancer HepG2 cells; Prolifera- tion; Apoptosis; Mechanism

肝癌是临床上常见的肝脏恶性肿瘤，其发病率居世界肿瘤发病率第5位[1]，病死率仅次于肺癌，位居世界恶性肿瘤病死率的第2位[2-3]。流行病学研究报告显示，2018年世界癌症新增病例中，肝癌患者的占比高达8.2%[4];我国肝癌发病率居世界首位[5]，每年新增肝癌患者人数占全球新增肝癌患者人数的50%以上[6]，现已成为严重威胁国民生命健康的重大问题。肝癌具有恶性程度高、易转移、易复发等特点[7]，臨床治疗难度大。目前，临床上肝癌主要以药物治疗为主，但是索拉菲尼等肝癌一线治疗药物长期使用易使患者产生耐受和多种不良反应（如高血压、肝功能异常、肾毒性等）[8-9]，严重影响药物的疗效及患者的预后。因此，探寻有效防治肝癌的药物是一个亟待解决的问题。

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果实，是被湖北省非物质文化遗产“武当山道教医药”代表性传承人陈吉炎教授建议优先发展的道地药材之一[10]。该药材主要含有环烯醚萜苷、鞣质、有机酸等化学成分[11-12]。其中，马钱苷（Loganin）是山茱萸中主要的环烯醚萜苷类成分[13]，同时也是山茱萸质量控制指标之一，其具有抗氧化、抗炎、调节免疫等多种药理学作用[14-15]。现代药理学研究表明，山茱萸具有降血糖、调节免疫、抗炎、抗氧化等作用，对肝癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤也具有抑制作用[16-17]。马钱苷作为山茱萸中主要的活性成分，对结肠癌细胞、人恶性黑色素瘤细胞均具有抑制作用[18-19]，提示该化合物具有开发成抗肿瘤药物的潜力。已有研究表明，山茱萸提取物能够抑制B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）的表达，同时活化胱天蛋白酶3（Caspase-3）从而诱导人肝癌细胞HepG2细胞凋亡[20-21]。为了进一步证明马钱苷是否同样也具有诱导肝癌细胞凋亡的作用，本研究以肝癌细胞HepG2为模型，考察不同浓度马钱苷对HepG2细胞增殖及凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机制，以期为马钱苷防治肝癌提供理论研究基础。

1 材料

1.1 仪器

MCO-15AC型CO2细胞培养箱（日本Sanyo公司）;Trans-Blot? TurboTM型全能型蛋白转膜仪、Power Pac Basic型电泳仪、xMark型酶标仪、TC20型细胞计数仪（美国Bio-Rad公司）;Allegra 64R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司）;NoVoCyte D2060R型流式细胞仪（艾森生物科技有限公司）;CKX31型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）;XB 220A型分析天平（瑞士Sartorius公司）;G：BOX型成像分析系统（英国Syngene公司）;MK-10型干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

马钱苷对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：4917，纯度：>98%）;胎牛血清（美国Gibco公司）;CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司，批号：CK04）;兔G1/S-特异性周期蛋白D1（Cyclin D1）单克隆抗体、小鼠增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、小鼠Bcl-2单克隆抗体、兔Caspase-3单克隆抗体、兔活化的胱天蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）单克隆抗体、兔Caspase-9单克隆抗体、兔Cleaved-Caspase-9单克隆抗体、兔β肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗（美国CST公司，批号：2978、2586、15071、9665、9664、9508、7237、4970、7074、7076）;Hoechst 33342荧光染料（北京索莱宝科技有限公司，批号：B8040）;磷脂酰丝氨酸蛋白抗体-荧光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGA107、KGA512）;BCA蛋白定量试剂盒、ECL超敏化学发光液、M-PERTM哺乳动物蛋白抽提试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：23227、34580、78501）;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司，批号：18D250）;DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.4）、胰蛋白酶、青霉素、链霉素均购自美国Hyclone公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。

1.3 细胞

HepG2细胞株购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

2 方法

2.1 细胞培养

取HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基（以下简称“培养基”），于37 ℃、5%CO2培养箱中培养（以下细胞培养条件相同）。

2.2 马钱苷对照品母液配制

精密称取马钱苷对照品20.0 mg，溶于1 mL培养基中，配成质量浓度为2×104 μg/mL的马钱苷对照品母液，经0.22 ?m微孔滤膜滤过，置于-20 ℃保存，备用。

2.3 马钱苷的细胞毒性考察

采用CCK-8法检测。取对数生长期HepG2细胞，按5 000个/孔接种于96孔板中，将细胞随机分为对照组和马钱苷不同浓度组，每组设6个复孔。马钱苷各浓度组细胞分别加入马钱苷终质量浓度分别为10、25、50、100、150、200、300、400 ?g/mL（浓度设置参考胡小红等[22]研究方法）的含药培养基100 μL，对照组细胞加入等体积培养基，另设不含细胞只含培养基的空白组。分别于培养24、48 h时，各孔加入CCK-8试剂10  μL，继续培养2 h，随后使用酶标仪于450 nm波长处测定各孔的吸光度（A），计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（A给药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。上述试验重复3次。

2.4 马钱苷对细胞凋亡的影响考察

采用Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡形态变化。取对数生长期的HepG2细胞，按1×106个/孔接种至6孔板中，将细胞随机分为对照组和马钱苷低、中、高浓度组，每组设3个复孔。细胞培养至单层细胞密度约90%左右时，弃去培养基，马钱苷低、中、高浓度组细胞分别加入马钱苷终质量浓度分别为50、100、150   ?g/mL的含药培养基5 mL，对照组细胞加入等体积培养基，培养24 h。收集细胞，经Hoechst 33342荧光染料避光染色10 min后，用PBS清洗5 min×3次，使用荧光显微镜观察各组细胞的形态变化。采用流式細胞术检测细胞凋亡率。另取HepG2细胞同上述方法分组、给药、培养24 h后，收集细胞，用细胞凋亡检测试剂盒中的Binding buffer 500 μL重悬，并加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液各5 μL，轻轻混匀，室温下避光孵育10～15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率：细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。上述试验重复3次。

2.5 马钱苷对细胞周期分布的影响考察

采用流式细胞术检测细胞周期分布。取对数生长期的HepG2细胞，按照“2.4”项下方法分组、给药，每组设3个复孔。培养24 h后，收集细胞，加入细胞周期试剂盒中的PI染液500 μL重悬，并避光孵育30 min后，使用流式细胞仪检测细胞周期分布。上述试验重复3次。

2.6 马钱苷对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响考察

采用Western blotting法检测蛋白表达。取对数生长期的HepG2细胞，按2×106个/皿接种至细胞培养皿中，按“2.4”项下方法分组。细胞培养至单层细胞密度约90%时，弃去培养基，马钱苷低、中、高浓度组细胞加入含马钱苷终质量浓度分别为50、100、150 ?g/mL的含药培养基10 mL，对照组细胞加入等体积培养基。培养24 h后，收集细胞，用M-PERTM哺乳动物蛋白抽提试剂提取细胞蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。将提取的细胞蛋白置于干式恒温器中于95 ℃变性5 min后即得蛋白样品。取蛋白样品40 ?g经过SDS-PAGE分离后，转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜（0.45 ?m）上，以5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入兔Cyclin D1单克隆抗体、小鼠PCNA单克隆抗体、小鼠Bcl-2单克隆抗体、兔Caspase-3单克隆抗体、兔Cleaved-Caspase-3单克隆抗体、兔Caspase-9单克隆抗体、兔Cleaved-Caspase-9单克隆抗体、兔β-actin单克隆抗体（稀释度均为1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育过夜;TBST清洗10 min×3次，再分别加入相应二抗（HRP标记羊抗兔IgG二抗对应Cyclin D1、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、β-actin蛋白，HRP标记羊抗小鼠IgG二抗对应PCNA、Bcl-2蛋白，稀释度均为1 ∶ 10 000），室温孵育1 h;用TBST清洗10 min×3次，经ECL试剂显色后采用成像分析系统成像，使用Image J 1.8.0图像软件处理，以目标蛋白与内参（β-actin）条带的灰度值比值作为目标条带的相对表达量。上述试验重复3次。

2.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。计量资料均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 马钱苷对细胞增殖的影响

与对照组比较，不同浓度马钱苷作用24、48 h后，细胞的存活率均显著降低（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖趋势。当马钱苷质量浓度为50 ?g/mL、作用24 h时的细胞存活率为（73.10±2.23）%，提示该条件下马钱苷具有明显的细胞毒性，故以50 ?g/mL作为后续试验中马钱苷给药的最低浓度，依次选择100、150 ?g/mL作为马钱苷给药的中浓度和高浓度，并选择24 h为作用时间。不同浓度马钱苷对HepG2细胞增殖的影响详见表1。

3.2 马钱苷对细胞凋亡的影响

Hoechst 33342染色结果显示，对照组细胞呈圆形或椭圆形，细胞核完整，边缘清晰，未见亮蓝色细胞核（核固缩）。经不同浓度马钱苷作用24 h后，各组细胞中细胞数均减少，且均出现不同程度的核固缩、碎裂等凋亡现象，其中高浓度组细胞此现象最显著。各组细胞凋亡形态学的显微镜图详见图1（图中箭头所指为凋亡细胞）。

与对照组比较，马钱苷低、中、高浓度组细胞的凋亡率均显著升高，且呈浓度依赖趋势（P<0.01）。各组细胞凋亡的散点图详见图2，凋亡率详见表2。

3.3 马钱苷对细胞周期分布的影响

经不同浓度马钱苷作用24 h后，马钱苷低、中、高浓度组的S期细胞百分比均较对照组显著升高，G2/M期细胞百分比均较对照组显著降低（P<0.05或P<0.01）;而G0/G1期细胞百分比与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。各组细胞周期分布的流式细胞图详见图3，细胞周期分布百分比详见表2。

3.4 马钱苷对细胞中Cyclin D1、PCNA蛋白表达的影响

与对照组比较，马钱苷低、中、高浓度组细胞中Cyclin D1、PCNA蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖趋势。各组细胞中Cyclin D1、PCNA蛋白表达的电泳图详见图4，相对表达量详见表3。

3.5 马钱苷对细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

与对照组比较，马钱苷低、中、高浓度组细胞中Cleaved-Caspase-3蛋白的相对表达量均显著升高、Caspase-3蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01）;马钱苷中、高浓度组细胞中Cleaved-Caspase-9蛋白的相对表达量均显著升高、Bcl-2和Caspase-9蛋白的相对表达量均显著降低（P<0.05或P<0.01）。各组细胞中凋亡相关蛋白表达电泳图详见图5，相对表达量详见表4。

4 讨论

肝癌恶性程度高，但早期症状轻微，不易察觉，故临床上肝癌早期诊断率较低，即使在发达国家，肝癌早期诊断患者也仅占30%左右，大部分肝癌患者在确诊时已进入晚期，这造成肝癌临床治疗难度大，严重影响患者生存质量[23-24]。虽然随着科学技术的进步，近年来我国肝癌发生率有所降低，但肝癌依然严重威胁人类生命健康。肿瘤细胞异常增殖和抗凋亡在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，因此针对肿瘤细胞的异常增殖和凋亡失衡对其进行干预性调节成为了干预肿瘤发生发展的重要治疗策略。

有研究表明，马钱苷在体外对人恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌细胞的恶性增殖均具有一定抑制作用[18-19，25]，但是關于马钱苷抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡的相关研究较少。本研究结果表明，不同浓度马钱苷对HepG2细胞增殖均具有抑制作用，且其抑制作用随马钱苷浓度增加呈现增大的趋势。通过Hoechst 33342荧光染色法与流式细胞术分析发现，不同浓度的马钱苷均能显著诱导HepG2细胞凋亡，同时将细胞周期阻滞于S期。

Cyclin D1是高度保守的细胞周期家族基因，能够调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）从而协调细胞增殖[26]，其在细胞周期过程中主要调控细胞周期G1/S期[27]。有研究表明，Cyclin D1在肝癌、乳腺癌、膀胱癌中呈过表达[28-29]，从而改变细胞周期进程，促使肿瘤发生。PCNA是反映细胞增殖状态的良好指标，能够促进肿瘤细胞的异常增殖[30]。本研究结果表明，马钱苷能够通过抑制Cyclin D1、PCNA基因蛋白的表达水平将细胞阻滞于S期，从而抑制HepG2细胞增殖。

肿瘤的发生、发展是一个复杂过程，在肿瘤形成过程中激活抗凋亡信号通路和/或抑制促凋亡信号能够促进细胞恶性转化，加速肿瘤形成[31]。目前研究得较为深入的与肿瘤发生发展密切相关的凋亡相关基因主要有Bcl-2家族、Caspases家族等，其中Bcl-2是重要的抗凋亡因子，能够增强细胞抵抗力，是肿瘤发生发展过程中重要的抗凋亡基因;而Caspases家族则是重要的诱导凋亡因子，其中Caspase-9是诱发凋亡的主要基因，Caspase-3是参与介导细胞凋亡的重要基因[32]。Caspase-3、Caspase-9能够降解DNA修复酶聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP），从而直接参与细胞凋亡[33-34]。Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9是Caspase-3、Caspase-9活化后的剪切形式，在细胞凋亡过程中Caspase-3、Caspase-9活化为其剪切形式进而发挥诱发细胞凋亡的作用。有研究指出，激活Caspases、抑制Bcl-2的表达能够促进肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用[35]。因此，调节肿瘤细胞凋亡相关蛋白的表达可作为诱导肿瘤细胞凋亡的一种策略。本研究结果表明，不同浓度的马钱苷能够抑制Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9等蛋白的表达，促进Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白的表达，提示马钱苷诱导肝癌HepG2细胞凋亡的作用可能与抑制Bcl-2蛋白的表达，促进Caspase-3、Caspase-9活化有关。山茱萸在我国多地均有分布，自然资源丰富，山茱萸既可食用又是中医临床上应用广泛的药物，具有巨大药用价值和功能食品开发潜能。马钱苷作为山茱萸中的主要活性成分，本研究为山茱萸抗肿瘤物质基础研究和应用开发提供了理论依据。接下来，本课题组将在动物实验中进一步研究马钱苷抑制肝癌的作用并探讨其作用机制，为马钱苷及山茱萸防治肝癌提供更多的理论依据。

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（收稿日期：2019-10-08 修回日期：2019-12-29）

（編辑：邹丽娟）