乙型肝炎病毒对不同ALT状态下慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞及其亚群的影响

高 鹏，雒艳萍，李俊峰

(1.兰州大学第一医院传染病研究室，甘肃 兰州 730030；2.兰州大学基础医学院免疫教研室，甘肃 兰州 730030)

乙型病毒性肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的以肝脏病变为主的一种传染病，其严重影响着人类的生命健康[1-2]。目前，全球有3.5～4.0亿人感染HBV，抗病毒治疗改善患者生活质量是全球医学界奋斗的重要任务[3]。以T淋巴细胞介导的细胞免疫反应紊乱是乙肝发病过程中的重要环节。有研究[4-5]显示：机体感染HBV后，常可出现T淋巴细胞及其亚群的紊乱，常表现为CD4+T淋巴细胞下降，CD8+T淋巴细胞升高，Th1/Th2淋巴细胞比例失衡。这种变化常造成细胞免疫功能不足，机体免疫功能下降，直接导致病毒清除困难，疾病迁延不愈。但有关HBV病毒载量高低与T淋巴细胞及其亚群关系的文献报道较少，特别是在不同丙氨酸氨基转移酶(alanine aminetransferase， ALT)水平状态下两者之间的关系目前研究甚少。ALT大于等于正常上限2倍增高，是临床抗病毒治疗乙肝的适应证之一。同时也根据ALT正常与否，将乙肝感染者分为HBV携带者和乙肝患者。研究[3]显示：HBV在不同ALT水平状态下，对机体的影响不同。但目前以ALT分组探讨不同ALT状态下HBV对T淋巴细胞及其亚群影响的文献报道少见。本研究探讨HBV在不同ALT状态下对T淋巴细胞及其亚群的影响，旨在阐明以ALT分组抗病毒治疗的免疫学机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年1月—2017年12月在兰州大学第一医院门诊和住院确诊为慢性乙肝的患者363例，其中男性280例，女性83例，年龄18～60岁。所选患者病例完整，经临床和实验数据分析后，其中ALT正常组慢性乙肝患者131例(ALT<40 U·L-1)，ALT大于等于正常上限且小于2倍增高组慢性乙肝患者110例(40 U·L-1≤ALT<80 U·L-1)，ALT大于等于正常上限2倍增高组慢性乙肝患者122例(ALT≥80 U·L-1)。并且按HBV载量分为低复制组(HBV DNA<4.0 lg copies·mL-1)、中复制组(4.0 lg copies·mL-1≤HBV DNA<6.0 lg copies·mL-1)和高复制组(HBV DNA≥6.0 lg copies·mL-1)。观察各组患者不同载量的HBV对T淋巴细胞总数、Th/i细胞数、Ts/c细胞数以及血清中白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)和白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)水平的影响。同时对ALT大于等于正常上限2倍增高的慢性乙肝患者给予恩替卡韦(0.5 mg·d-1)治疗，随访24周，观察抗病毒治疗前后患者机体病毒学及免疫功能的改变。慢性乙肝的诊断标准符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》[6]的诊断标准。同时排除妊娠期妇女、中度和重度脂肪肝患者、酒精性肝病患者、药物性肝损伤患者、自身免疫性肝损伤患者、曾经接受过抗病毒治疗的患者和并发其他肝炎感染的患者，以及并发其他心血管和肾脏等重大脏器病变患者。

1.2 主要仪器

荧光定量PCR分析仪购自德国 Lightcycler ROCH公司，流式细胞仪(FACS Calibur)和配套试剂购自美国BD公司，AU400型全自动生化分析仪购自日本Olympus公司，XE2100型全自动血细胞计数仪购自日本Sysmex公司。

1.3 方 法

1.3.1 乙肝两对半定量检测 采集患者静脉血并分离血清，按罗氏 Cobas e 601 化学发光免疫分析仪的操作步骤进行定标及样本检测。

1.3.2 乙肝病毒DNA检测 采集患者静脉血并分离血清，按HBV DNA 定量检测试剂盒和基因扩增仪操作步骤进行检测，敏感度 >500 copies·mL-1。

1.3.3 外周血细胞分类计数 无菌操作采集静脉血 2～3 mL，EDTA-K2 抗凝，XE2100型全自动五分类血细胞分析仪进行淋巴细胞计数检测。

1.3.4 CD3、CD4和CD8 单抗标记的制备 取100 μL EDTA-K2 抗凝血加入20 μL 三色单克隆抗体(抗 CD3 PE-CY5/抗 CD4-FITC/抗 CD8-PE)，阴性对照取 100 μL EDTA-K2 抗凝血加入20 μL鼠抗人 IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE，混匀，室温放置20 min。 加入Muti-Q-Prep 溶血剂处理，每份标本均做测定管和阴性对照管。

1.3.5 T淋巴细胞分类检测 流式细胞仪(FACS Calibur)开机预热30 min 后，用 Flow-check 荧光微球进行光路流路校正，将HPCV 调节在 2% 以内前向和侧向散射信号采用线性放大，荧光信号采用对数放大，检测淋巴细胞表面CD3、CD4和CD8表达，其阳性表达以百分率(%)表示。

1.3.6 血清细胞因子检测 采集患者静脉血并分离血清，按IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10检测试剂盒的操作步骤进行ELISA法检测，检测患者血清中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 ALT正常组不同HBV载量慢性乙肝患者免疫功能指标

在ALT正常组，不同HBV载量患者 T 淋巴细胞总数，Th/i淋巴细胞数，Ts/c淋巴细胞数，血清IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 ALT正常组不同HBV载量慢性乙肝患者免疫功能指标

GroupnT lymphocyte(CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+ CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+ CD8+)(η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)IL-4[ρB/(ng·L-1)IL-10[ρB/(ng·L-1)Low replication4364.28±12.5744.95±8.9521.25±6.7238.29±21.2610.02±3.0143.25±21.5216.27±6.24Middle replication4663.25±11.2745.19±9.2520.62±6.5837.51±19.669.98±3.1244.82±20.4715.58±6.08High replication4262.98±13.5443.68±10.02 19.75±6.2139.64±22.5111.21±3.2740.81±18.9515.23±5.89F0.195 20.264 61.658 30.593 10.726 80.681 70.954 0P0.736 30.623 50.193 70.563 00.325 30.483 90.246 0

2.2 ALT大于等于正常上限且小于2倍增高组不同HBV载量慢性乙肝患者免疫功能指标

在ALT大于等于正常上限且小于2倍增高组，随着HBV载量的增高患者血清IL-2和IFN-γ水平升高(P<0.05)，而其他指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 ALT大于等于正常上限2倍增高组不同HBV载量慢性乙肝患者免疫功能指标

在ALT大于等于正常上限2倍增高组，随着HBV载量的增加，T 淋巴细胞总数和Th/i淋巴细胞数明显下降(P<0.05)，Ts/c淋巴细胞数明显升高(P<0.05)；在Th细胞亚群方面，随着HBV载量的增加反映Th1细胞的细胞因子IL-2和IFN-γ水平明显升高(P<0.05)，而反映Th2细胞的细胞因子IL-4和IL-10水平明显下降(P<0.05)。见表3。

表2 ALT大于等于正常上限且小于2倍增高组不同HBV载量慢性乙肝患者免疫功能指标

GroupnT lymphocyte (CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+ CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+ CD8+)(η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Low replication3858.76±12.8540.22±8.1630.28±5.9641.65±20.2115.87±10.5243.28±17.6517.63±6.91Middle replication3557.93±12.1741.16±8.3531.08±5.8952.46±21.2319.86±11.08844.21±18.9616.51±7.27High replication3758.23±13.3440.46±8.7931.19±5.7157.38±24.5623.93±12.5741.87±18.0616.38±7.08F0.525 40.468 80.312 111.221 710.653 50.319 40.413 6P0.610 00.716 10.736 6<0.01<0.010.735 00.758 2

表3 ALT大于等于正常上限2倍增高组不同HBV载量慢性乙肝患者免疫功能指标

GroupnT lymphocyte (CD3+ )(η/%)Th/i(CD3+CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+CD8+) (η/%)IL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Low replication3956.19±13.0538.41±6.7934.62±6.8060.57±26.5428.07±14.4738.46±20.5114.15±7.03Middle replication4153.42±11.2335.63±6.2836.92±6.5277.52±30.5135.52±22.5435.06±19.1311.15±7.26High replication4250.01±10.0832.63±6.0838.89±7.0685.84±32.5443.52±26.8132.08±18.339.13±6.54F 11.025 210.354 411.251 69.541 713.582 415.526 48.574 9P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

2.4 ALT大于等于正常上限2倍增高组慢性乙肝患者恩替卡韦抗病毒治疗前后病毒学和血清学指标

对于ALT大于等于正常上限2倍增高组122例慢性乙肝患者采用恩替卡韦抗病毒治疗(0.5 mg·d-1)，治疗前后病毒学和血清学指标变化进行配对t检验。与治疗前比较，治疗后患者HBV DNA、HBsAg和HBeAg明显降低(P<0.05)；HBV DNA完全应答率为72.95%，部分应答率为89.34%，HBeAg血清学转换率为17.07%，有1例患者发生HBsAg阴转，阴转率为0.82%。见表4。

表4 ALT大于等于正常上限2倍增高组慢性乙肝患者恩替卡韦抗病毒治疗前后病毒学和血清学指标

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2.5 ALT大于等于正常上限2倍增高组慢性乙肝患者恩替卡韦抗病毒治疗前后免疫学指标

对于ALT大于等于正常上限2倍增高的122例慢性乙肝患者采用恩替卡韦抗病毒治疗(0.5 mg·d-1)，治疗前后免疫学指标变化进行配对t检验。与治疗前比较，治疗后患者T 淋巴细胞总数和Th/i淋巴细胞数明显升高(P<0.05)，Ts/c淋巴细胞明显下降(P<0.05)。在Th细胞亚群方面，与治疗前比较，患者血清中反映Th1细胞的细胞因子IL-2和IFN-γ水平明显下降(P<0.05)，反映Th2细胞的细胞因子IL-4和IL-10水平明显升高(P<0.05)。见表5。

表5 ALT大于等于正常上限2倍增高组慢性乙肝患者恩替卡韦抗病毒治疗前后免疫学指标

GroupHBV DNA(lg copies·mL-1)T lymphocyte (CD3+)(η/%)Th/i(CD3+CD4+) (η/%)Ts/c(CD3+CD8+) (η/%)Before treatment6.46±1.9753.35±12.6536.59±6.7936.17±6.12After treatment3.62±1.2061.29±11.6643.46±8.3921.78±7.56t12.305 516.032 117.195 911.531 0P<0.01<0.01<0.01<0.01GroupIL-2[ρB/(ng·L-1)]IFN-γ[ρB/(ng·L-1)]IL-4[ρB/(ng·L-1)]IL-10[ρB/(ng·L-1)]Before treatment78.69±30.2835.07±14.4736.11±20.2512.39±7.01After treatment38.31±20.2410.15±4.7544.80±20.1116.32±6.77t18.542 317.974 415.235 113.710 7P<0.01<0.01<0.01<0.01

3 讨 论

HBV感染人体后，可处于不同的免疫状况，临床上根据症状、体征和肝功能指标，特别是ALT是否正常将其分为HBV携带者和乙肝患者，HBV携带者多数无明显症状体征，肝功能轻度受损， ALT多为正常或轻度增高[7-8]。而乙肝患者大多出现黄疸、厌食和乏力等症状和体征。肝功能严重受损，其中ALT多出现2倍以上增高[9]。同时ALT大于等于正常上限2倍增高是临床抗病毒治疗乙肝的适应证之一。这得到了广大肝病界专家的共识，而且也被写进乙肝治疗指南中。相关文献[10-11]报道：HBV感染人体后，其发生发展与机体的免疫功能，特别是以T淋巴细胞为主的细胞免疫功能有密切联系。但是目前很少有文献以ALT为节点，探讨不同ALT状态下HBV对T淋巴细胞及其亚群的影响。

本研究结果显示：在ALT正常组，不同载量的HBV对T淋巴细胞及其亚群的影响无明显差别，这是因为在此阶段，多为HBV携带者[12]，机体多数处于免疫耐受状态，HBV在机体内与机体免疫系统达成平衡状态，不管载量的高低，均未引起强烈的免疫反应，故病毒载量与机体的免疫细胞数量无明显相关性[13-14]。当然也有可能在此阶段，机体的免疫系统未充分识别出乙型肝炎病毒，不论载量高低，机体均未对其做出强烈的免疫应答，未能引出强烈的细胞免疫应答和体液免疫应答，因此在此阶段病毒载量与免疫效应细胞数量上无相关性[15]。因此对此阶段的HBV感染者，临床上多以密切观察为主，而不采用抗病毒治疗。

而在ALT异常组，特别是ALT大于等于正常上限2倍组中，随着病毒载量的增加T淋巴细胞总数和CD4+T淋巴细胞数明显下降，CD4+T淋巴细胞是机体抗病毒的主要细胞，CD4+细胞通过分泌细胞因子，以促进特异性B细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)成熟和增殖，具有较强的抗病毒效应[16-17]。而在T淋巴细胞亚群方面，随着病毒载量的升高，反映Th1细胞的细胞因子IL-2和IFN-γ水平明显升高。反映Th2细胞的细胞因子IL-4和IL-10水平明显下降。Th1细胞的诱导分化与病毒清除有关,并同时与肝组织的病理损伤有关，Th2细胞的诱导分化能抑制Thl细胞的分化,导致HBV感染的慢性化,又有利于防止Th1细胞应答过度而造成的病理损伤[18-19]。正常机体Th1/Th2处于相对平衡，互相协调，互相制约，而在免疫应答阶段这种平衡被打破，机体免疫功能处于紊乱状态[20-21]，在本研究中表现为随着病毒载量的增高，Th1/Th2的平衡被打破，机体免疫功能处于紊乱状态。在此阶段，乙肝患者多出现黄疸、厌食和乏力等症状及体征。病程迁延不愈，大多与机体的免疫功能失常有关。对乙肝患者，临床上多积极抗病毒治疗。

本研究探讨了恩替卡韦抗病毒治疗24周前后患者病毒指标及免疫功能指标的变化，恩替卡韦是核苷酸类似物，具有强效的抗病毒治疗效果，经抗病毒治疗24周后，患者HBV DNA明显清除，机体获得了抗病毒治疗应答，HBeAg明显阴转，T淋巴细胞总数和CD4+T淋巴细胞数明显上升，IL-2和IFN-γ水平明显下降，IL-4和IL-10水平明显升高，Th1/Th2的平衡恢复正常。表明抗病毒治疗可以有效地改善患者的免疫功能，HBV载量下降，可以减缓机体的病理性免疫反应，减少对机体的损伤。

综上所述，不同的ALT状态下，HBV载量高低对机体免疫功能有不同的影响，并且对于ALT大于等于正常上限2倍增高的乙肝患者积极进行抗病毒治疗可以明显改善机体的免疫状态。因此区分判断这一点，有助于临床对病毒免疫机制的认识，并采用适当的方式抗病毒治疗。