高效毛细管电泳法测定热毒宁注射液中阴阳离子和小分子有机酸成分的含量＊

葛 雯，杨 彪，于 洋，康经武，李海波＊＊，王振中＊＊

（1. 浙江医药高等专科学校中药学院 宁波 315100；2. 江苏康缘药业股份有限公司中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001；3. 中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室 上海 200032；4. 暨南大学中药及天然药物研究所 广州 510632）

热毒宁注射液为江苏康缘药业股份有限公司在名老中医临床经验方的基础上自主研发的原国家中药二类新药，由青蒿、金银花和栀子3 味常用中药组成，具有清热、疏风、解毒的功效，临床上主要用于治疗外感风热所致的感冒、咳嗽、上呼吸道感染、手足口病以及流感引起的高热不退等[1-4]，临床应用广泛，效果显著。且热毒宁注射液自2005年上市后，先后被列入国家医保目录和中央药品储备品种。2010年，被列入卫生部颁布的《手足口病诊疗指南（2010年版）》、《甲型H1N1 流感诊疗方案（2010年版）》以及《人感染H7N9 禽流感诊疗方案》[5]。2013年，热毒宁注射液的核心专利技术获得第十五届中国专利奖金奖[6]。2014年，再次被列入《人感染H7N9 禽流感诊疗方案（2014年版）》[7]，并且被列入《登革热诊疗指南（2014年第2版）》[8]。2017年，仍然被列入《人感染H7N9 禽流感诊疗方案（2017年第1版）》[9]。2019年，新型冠状病毒爆发，热毒宁注射液被国家卫生健康委员会先后列入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》和《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[10，11]。因此，完善热毒宁注射液的质量标准具有重大的社会意义。

查阅文献可知，热毒宁注射液中化学成分复杂，除环烯醚萜苷类、黄酮类、倍半萜类和糖类等成分外，热毒宁注射液中还包括阴阳离子和小分子有机酸等亲水性成分[12-18]。为进一步提升热毒宁注射液中结构明确成分占总固含物的比例，从而完善热毒宁注射液的质量控制标准，本项目组前期研究先后建立了热毒宁注射液的多成分定量分析方法及指纹图谱[19-23]、总有机酸含量[24]、糖类成分[25]、细菌内毒素[26]、有害元素铅砷镉汞铜[27]、高分子物质[28]、聚山梨酯80[29]以及有机溶剂残留[30]等相关含量控制方法。此外，注射剂的渗透压是考察注射剂安全性的重要参数，而其渗透压摩尔浓度与钠（Na）、钙（Ca）等离子浓度密切相关[31，32]。因此，为了完善热毒宁注射液的质量标准，本研究旨在于建立热毒宁注射液中未报道的无机阴阳离子和有机酸的含量测定方法。

然而，由于中药制剂成分的复杂性，对其中的亲水性成分的定量分析常常比较困难。毛细管电泳（Capillary electrophoresis, CE）又称高效毛细管电泳（High-performance capillary electrophoresis, HPCE）或毛细管电分离法（Capillary electro-separation method,CESM），是近十几年来发展起来的一种高效分离分析技术。它具有分离模式多、量微、快速、溶剂消耗少、柱子便宜且易于清洗等优点[33，34]，非常适合生产和保存过程中无机离子和小分子有机酸的含量测定[35，36]。因此，本研究建立了一种高效毛细管电分离法，同时对热毒宁注射液中无机阴阳离子、小分子有机酸等亲水性成分进行含量测定。该方法简捷灵敏，可为热毒宁注射液的质量标准提升奠定一定的基础。

1 仪器与试药

仪器为P/ACE MDQ 毛细管电泳仪（Beckman Coulter,CA,USA），弹性石英毛细管柱（50 μm×60 cm，有效长度49.5 cm，美国Micropolymer Co.）；0.22 μm 针式滤器（上海安谱有限公司）。Sartorius PB-20 标准型pH 计（北京赛多利斯仪器系统有限公司），天平（Satorius BS124S）。

氯化钠（Sodium Chloride）（天津市博迪化工有限公司）；L-苹果酸（L-Malic Acid）购自于国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾（Potassium Hydrogen Phthalate, KHP）和十六烷基三甲基氯化铵（Hexadecyl Trimethyl Aammonium Chloride, CTAC）均购自于阿拉丁试剂有限公司；氯化钾（Potassium Chloride）（中国联试化工试剂有限公司）；咪唑（Imidazole,Fluka）；α-羟基异丁酸（α-Hydroxyisobutyric acid, Fluka）；18-冠-6（18-crown-6, Aldrich）。甲醇（色谱纯，Tedia，USA），乙腈（色谱纯，Tedia，USA），超纯水由Mill-Q 纯水系统制得（Millipore, USA），其它试剂均为分析纯，购于南京化学试剂有限公司。

热毒宁注射液，批号分别为Z160706、Z160707、Z160708、Z160709、Z160710、Z160711、Z160712、Z160713、Z160714、Z160715，均为江苏康缘药业股份有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的配制

精确称取氯化钠和L-苹果酸标准品，配制成无机阴离子与小分子有机酸的标准溶液储备液，每种标准品浓度均为1000 μg·mL-1。

精确称取氯化钠和氯化钾标准品，均配制成浓度为1000 μg·mL-1的无机阳离子的标准溶液储备液。

2.2 供试品溶液的配制

准确取热毒宁注射液成品10 个批次各1 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入50%甲醇近刻度，超声处理30 min，放冷，用50%甲醇定容至刻度，12000 r·min-1离心10 min，取上清液作为供试品溶液。

2.3 缓冲溶液的选择

阴离子及小分子有机酸测定的背景电解质：8%甲醇的20 mmol·L-1邻苯二甲酸氢钾溶液，0.25 mmol·L-1十六烷基三甲基氯化铵为电渗流改性剂，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至5.8。

阳离子测定的背景电解质：12 mmol·L-1咪唑，6 mmol·L-1α-羟基异丁酸为金属离子络合剂，用0.5 mol·L-1盐酸溶液调节缓冲液pH值至4.0。

2.4 电泳条件

阴离子及小分子有机酸电泳条件：弹性石英毛细管柱（50 μm × 60 cm，有效长度49.5 cm），进样压力：0.6 psi×6 sec；电泳分离电压：-12 kV；柱温为25℃；检测波长为232 nm。每天使用前依次用1 mol·L-1NaOH冲洗5 min，超纯水冲洗5 min；两次样品分析之间用1 mol·L-1NaOH、超纯水、缓冲液各冲洗5 min（图1）。

阳离子电泳条件：弹性石英毛细管柱（50 μm×60 cm，有效长度49.5 cm），进样压力：0.6 psi × 8 sec；电泳分离电压：15 kV；柱温为25℃；检测波长为214 nm。每天使用前依次用0.5 mol·L-1盐酸冲洗4 min，去离子水冲洗4 min；两次样品分析之间用0.5 mol·L-1盐酸、超纯水、缓冲液各冲洗4 min（图2）。

图1 标准品溶液（A）和供试品溶液（B）中无机阴离子及小分子有机酸的电泳谱图

图2 标准品溶液（A）和供试品溶液（B）中无机阳离子的电泳谱图

2.5 线性关系、检测限（LOD）和定量限（LOQ）的考察

将2种阳离子的储备液用超纯水配成质量浓度为2.5、10、25、50、100、150、200、300 μg·mL-1的混合标准品溶液，将Cl-和L-苹果酸的储备液用超纯水配成质量浓度为5、10、20、40、60、100、200、250、500 μg·mL-1的混合标准品溶液。不同浓度的溶液依次进样，平行测定3 次。以各分析物的峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg·mL-1）进行线性回归，得到线性回归方程、相关系数、检出限LOD（3 倍信噪比所对应的浓度）、定量限LOQ（10 倍信噪比所对应的浓度）及线性浓度范围（表1）。可知，K+和Na+的检出限分别为0.70 μg·mL-1、0.21 μg·mL-1，Cl-和L-苹果酸的检出限分别为2.10 μg·mL-1、3.10 μg·mL-1，表明该方法灵敏度高，满足样品测定要求。并且，上述4种分析物在各自的线性范围内的线性相关系数范围为0.9961-0.9993，说明线性关系良好。

表1 线性关系、检测限和定量限考察结果

2.6 精密度试验

精密量取“2.2”项下的无机阳离子标准溶液储备液和无机阴离子与小分子有机酸的标准溶液储备液，分别配成质量浓度为100 μg·mL-1的无机阳离子混合标准品溶液和质量浓度为60 μg·mL-1的无机阴离子与小分子有机酸混合标准品溶液，将2种混合标准溶液按照“2.4”项下的电泳分析条件，1日内连续进样6 次进行分析测定，以峰面积计算得相对标准偏差（Relative Standard Deviation,RSD）作为日内精密度；连续6日同一时间段分析测定，以峰面积计算相对标准偏差为日间精密度，两者结合以考察方法的精密度。结果K+、Na+、Cl-、L-苹果酸日内精密度的RSD 值（n=6）分别为1.83%、1.53%、1.57%和1.79%，日间精密度的RSD 值（n= 6）分别为3.02%、10.44%、1.20% 和1.23%，说明该方法的精密度良好。

2.7 重复性试验

取同一批次（批号Z160710）热毒宁注射液，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.4”项下的电泳条件进行检测，记录其峰面积，计算得相对标准偏差RSD考察方法的重复性。结果K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的RSD 值（n= 6）分别为5.61%、3.03%、2.74%和3.00%，说明该方法具有良好的重现性。

2.8 稳定性试验

以批号为160710 的热毒宁注射液成品作为方法学考察的样品，按照“2.2”项下的方法配制供试品溶液，室温下放置，按照“2.4”项下的电泳分析条件进行检测，以同一样品在同一天实验，记录其峰面积，计算得日内相对标准偏差RSD。以同一样品连续6天进行平行实验，记录其峰面积，计算得日间相对标准偏差RSD 考察其无机阴阳离子及小分子有机酸的稳定性。结果K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的日内RSD 值分别为1.46%、1.60%、1.80%、3.10%；日 间RSD 值 分 别 为1.75%、1.96%、0.17%、9.6%。说明无机阴阳离子及小分子有机酸在热毒宁注射液中稳定性较好。

2.9 加样回收试验

以已知含量的热毒宁注射液成品（批号为160710）作为方法学考察的样品，对达到定量限的无机阴阳离子和小分子有机酸进行加样回收率的测定。准确取热毒宁注射液成品0.5 mL，以1:1 的比例加入相应的K+、Na+、Cl-和L-苹果酸，按照“2.2”项下的方法平行配制6 份样品溶液，再按照“2.4”项下的电泳分析条件进行检测，计算加样回收率，结果K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的平均回收率分别为89.1%、106.8%、120.1%、120.7%，RSD值分别为1.57%、7.19%、4.1%、2.8%。

3 亲水性成分的含量测定

取批号为Z160706、Z160707、Z160708、Z160709、Z160710、Z160711、Z160712、Z160713、Z160714、Z160715 的热毒宁注射液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下的检测条件测定各成分含量，结果10 批次热毒宁注射液中K+、Na+、Cl-和L-苹果酸 的 平 均 含 量 分 别 为387.68、3941.25、1595.33、690.58 μg·mL-（1表2）。

表2 10批热毒宁注射液中阳离子、阴离子及小分子有机酸含量（μg·mL-1）

4 讨论

本项目组前期采用高效液相色谱法、紫外分光光度法、电感耦合等离子质谱法等技术对热毒宁注射液中绿原酸等18个结构明确成分、总有机酸、糖类、细菌内毒素、有害元素铅砷镉汞铜、高分子物质、聚山梨酯80 以及有机溶剂残留的含量进行测定，但未见对热毒宁注射液中小分子有机酸及无机阴阳离子的相关报道。因此，为进一步提升热毒宁注射液中结构明确成分占总固含物的比例，完善热毒宁注射液的质量控制标准，本研究拟建立热毒宁注射液中无机阴阳离子和小分子有机酸的含量测定方法。

高效液相色谱法可以用于测定小分子有机酸和无机阴离子的含量，但测定时需使用不同的色谱柱（小分子有机酸：反相色谱柱；无机阴离子：离子交换色谱柱）[37，38]，而毛细管电泳法只需改变电泳电压和进样压力便可完成注射液中无机阴阳离子和小分子有机酸的含量测定，更加简便、快捷。因此，本研究采用高效毛细管电泳法，同时对热毒宁注射液中无机阴阳离子、小分子有机酸进行含量测定。

细内径的弹性石英毛细管的分离效果较好，且焦耳热小，可施加较高的电压；加大毛细管柱两端电泳电压能缩短分析时间，但加大电泳电压的同时会使仪器的噪音增加；综合考虑上述因素，最终确定使用内径为50 μm 的弹性石英毛细管柱，电泳电压分别为-12 kV（阴离子及小分子有机酸）和15 kV（阳离子）。

预实验中，本课题组共选择4种无机阴离子（Br-、、6种无机阳离子Mg2+、Zn2+，其中与K+的分离通过添加1.4 mmol·L-118-冠-6 来实现）以及7种小分子有机酸（甲酸、酒石酸、L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸、乳酸）配置对照品，实验结果显示，热毒宁注射液中除Na+、甲酸、L-苹果酸、琥珀酸、醋酸、乳酸外的其他阴阳离子和小分子有机酸的含量均低于检测限，且该注射液中、甲酸、琥珀酸、醋酸以及乳酸的含量均低于定量限。因此，最终确定K+，Na+，Cl-和L-苹果酸为本次应用高效毛细管电泳法测定热毒宁注射液中阴阳离子和小分子有机酸的含量的指标性成分。

本次实验应用毛细管电泳法对热毒宁注射液中K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的含量进行测定，各被测成分专属性强，无杂质干扰，方法学考察结果显示，在各成分的线性范围内，回归方程的线性关系良好，仪器的精密度和方法的重复性均良好，且6 天内无机阴阳离子及小分子有机酸在热毒宁注射液中稳定性较好。

本方法的方法学考察符合2015年版《中国药典》的相关要求，且能快速、准确、灵敏地同时测定热毒宁注射液中K+、Na+、Cl-和L-苹果酸的含量，其范围分别为：300.25-505.00、3248.00-4520.50、1374.00-1736.25和637.00-786.00 μg·mL-1。为满足《中药、天然药物注射剂基本技术要求》中“总固体中结构明确成份的含量应不少于60%”的标准，完善热毒宁注射液的质量控制标准奠定了一定的基础。