苍术白术配伍对于脾虚泄泻小鼠的药效学比较研究*

邯郸市中医院

孙胜振 刘晓兰△ 杨丽萍△ 刘会丽△(邯郸 056000)

提要 目的：对苍术白术配伍治疗实验性小鼠脾虚泄泻的作用及机制进行比较研究。方法：将50只小鼠灌胃番泻叶水煎液14 d，复制脾虚泄泻模型。将造模成功的小鼠随机分为模型组，阳性组，配伍组、苍术组和白术组，每组10只。另设空白组小鼠10只。各组小鼠连续灌胃给药或给水7 d,末次给药后，用半固体营养糊法检测小鼠胃残留率和小肠推进率；取血浆，Elisa法检测其中小鼠胃动素(MTL)和小鼠血管活性肠肽(VIP)含量，取结肠组织，Elisa法检测其中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量，western blot法检测其中水通道蛋白3(AQP3) 蛋白表达水平。结果：苍术、白术和两药配伍皆能明显增加脾虚泄泻小鼠的胃残留率和血浆中的MTL含量，明显降低小肠推进率和血浆VIP、结肠组织中IL-1β、TNF-α含量，上调APQ3的蛋白表达水平。其中，苍术对IL-1β、TNF-α和AQP3的蛋白表达影响较为显著，而白术则重在调节胃肠运动和激素水平。结论：苍术和白术配伍能够相辅相成，对小鼠脾虚泄泻有较好的改善作用。

苍术、白术六朝前统称为“术”。[1]术从本经时期就受到了各大医家的关注。随着药物与方剂使用的进展，两药的区别与配伍逐渐被提出。其中，苍术以苦温燥湿为主，为运脾要药；白术以健脾益气为主，为补脾要药；两药配伍，一散一补，可使水湿得以运化，脾胃纳运如常，因此可用于食欲不振、恶心呕吐、脘腹胀满、肠鸣泄泻等症的治疗。[2]但两药的配伍尚缺少现代研究。在本项研究中，通过复制脾虚泄泻小鼠模型，分别以苍术、白术和两药配伍进行治疗，就两药配伍的作用和可能机制进行探讨。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠60只，雄性，3月龄，体质量(18±5)g，购自北京斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，动物许可证编号为：1103241911029433。动物饲养于SPF级实验室，恒温恒湿，12 h白昼，12 h黑夜，自由采食灭菌饲料和去离子水。

1.2 试剂与试药

苍术、白术和番泻叶均购自邯郸市中医院，经邯郸市中医院主任药师鉴定为正品。苍术、白术及苍术白术配伍均分别以水浸渍30 min，并分别加水煎煮2次，第1次15 min，第2次10 min，合并2次水煎液，浓缩至1 g生药/mL；番泻叶以水浸渍30 min，加水煎煮2次，每次10 min，合并2次水煎液，浓缩至1 g生药/mL；参苓白术散，北京同仁堂股份有限公司(18101033)，以去离子水配置为 0.45 g/mL混悬液。半固体营养糊，将羧甲基纤维素、奶粉、糖、淀粉加水和碳素墨水调和为糊状物。小鼠胃动素(MTL)Elisa检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司(SBJ-M0543)；小鼠血管活性肠肽(VIP)Elisa检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司(SBJ-M0082)；小鼠白细胞介素1β(IL-1β)Elisa检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司(SBJ-M0583)；小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)Elisa检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司(SBJ-M0030)；水通道蛋白3(AQP3)兔多克隆抗体，美国Abacm生物科技有限公司(ab153694)。

1.3 实验仪器

酶标仪(美国 Thermo 公司)，迷你电泳槽、迷你转印仪(美国 Bio-Rad 公司)，化学发光仪(法国 Vilber Lourmat 公司)。

2 实验方法

2.1 模型制备

依照文献中方法，50只小鼠每日灌胃番泻叶水煎液0.2 mL/10 g体质量，连续14 d，复制脾虚泄泻小鼠模型。造模后，小鼠出现腹泻、粪便稀溏、纳呆、精神萎靡、活动减少、体质量减轻，则为造模成功。

2.2 分组与给药

将造模成功的小鼠按体质量随机分为模型组、阳性组(灌胃参苓白术散混悬液)、苍术组(灌胃苍术水煎液)、白术组(灌胃白术水煎液)和配伍组(灌胃苍术白术水煎液)，每组10只。另设空白组小鼠10只。各给药组小鼠每日灌胃给药1次，空白组、模型组给水1次，给药、水容量为0.2 mL/10 g体质量，连续7 d。

2.3 指标检测

各组小鼠末次给药后禁食12 h，摘眼球取血后快速处死，检测小鼠胃残留率和小肠推进率；剪取结肠约3 cm，冻存。

2.3.1 半固体营养糊法测定小鼠胃残留率和小肠推进率：末次给药后，禁食12 h，小鼠灌胃半固体营养糊0.5 mL/只，20 min后，小鼠取血后快速处死，开腹，剪取胃和幽门至回盲部肠管，置于托盘上。称量胃质量和清理内容物后的胃空质量，按照下式计算胃残留百分率；测量小肠全长和半固体营养糊在小肠内的推进距离，并按下式计算小肠推进百分率。

胃残留率(%)=

推进率 (%) =

2.3.2 Elisa法检测小鼠血浆中MTL和VIP含量：小鼠摘眼球取血，将血采集至加有肝素钠的EP中，混匀后得血浆。以Elisa检测试剂盒检测血浆中MTL和VIP含量。

2.3.3 Elisa法检测小鼠结肠组织中IL-1β、TNF-α含量：剪取小鼠结肠约1 cm，纵向剖开，生理盐水冲洗后匀浆。以Elisa检测试剂盒检测匀浆上清液中IL-1β、TNF-α含量。

2.3.4 western blot法检测小鼠结肠组织中AQP3的蛋白表达水平：取结肠组织约500 mg，加入蛋白裂解液2 mL充分裂解，离心取上清，进行蛋白质含量测定后，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，8%脱脂奶粉封闭2 h，加入目标蛋白的一抗4℃过夜，再以二抗室温孵育1 h，化学发光仪检测。以目标条带光密度值比内参β-actin条带光密度值作为目标蛋白的相对表达量。

2.4 数据统计

3 实验结果

3.1 对小鼠胃残留率和小肠推进率的影响

与空白组相比，模型组小鼠的胃残留率显著降低(P<0.01)，小肠推进率则显著增加(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、配伍组和白术组的小鼠胃残留率显著提高(P<0.01)，小肠推进率显著降低(P<0.01)；苍术组则胃残留率明显提高(P<0.05)，小肠推进率明显降低(P<0.05)。与配伍组相比，苍术组胃残留率差异有显著性(P<0.05)。详见表1。

表1 对小鼠胃残留率和小肠推进率的影响

3.2 对小鼠血浆中MTL和VIP含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠血浆中MTL含量显著降低(P<0.01)，而VIP含量则显著升高(P<0.01)。与模型组相比，阳性组小鼠血浆MTL含量显著升高(P<0.01)，配伍组和白术组也明显升高(P<0.05)，苍术组亦升高但差异无显著性(P>0.05)；阳性组、配伍组和白术组小鼠血浆中VIP含量显著降低(P<0.01)，苍术组也明显降低(P<0.05)。与苍术组相比，阳性组、配伍组和白术组小鼠血浆中MTL含量均明显升高(P<0.05)。详见表2。

3.3 小鼠结肠组织中IL-1β、TNF-α含量的影响

与空白组相比，模型组小鼠结肠组织中IL-1β和TNF-α含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、配伍组和苍术组小鼠结肠组织中IL-1β含量显著降低(P<0.01)，白术组也明显降低(P<0.05)；配伍组小鼠结肠组织中TNF-α含量显著降低(P<0.01)，阳性组和苍术组也明显降低(P<0.05)，白术组亦降低但差异无显著性(P>0.05)。详见表3。

表2 对小鼠血浆中MTL和VIP含量的影响

组别nIL-1β/(pg·mgpro-1)TNF-α/(pg·mgpro-1)空白组1016.53±3.68∗∗19.08±3.94∗∗模型组1022.32±7.4325.24±4.72阳性组1017.59±4.16∗∗20.53±5.34∗配伍组1016.41±3.20∗∗19.60±4.38∗∗苍术组1016.59±4.30∗∗20.11±4.06∗白术组1018.12±2.75∗22.73±4.04

3.4 对小鼠结肠组织中AQP3的蛋白表达水平的影响

与空白组相比，模型组小鼠结肠组织中AQP3的蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、配伍组和苍术组的小鼠结肠组织中AQP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，白术组也明显升高(P<0.05)。与白术组比，阳性组、配伍组和苍术组的小鼠结肠组织中AQP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。结果见图1、图2。

注：与模型组相比，*PPP

图2 对小鼠结肠组织中AQP3的蛋白表达水平的影响

4 讨论

中医学认为，脾主运化，乃后天之本，气血生化之源。若过量服用寒凉药物，或饮食失节，或劳倦伤脾均可致脾失健运，水谷津液输布失常，水湿清浊不分，混杂而下，出现泄泻。主要表现为消瘦乏力、纳少、身弱怯冷、四肢倦怠、脘腹胀满、便溏腹泻等。[3]中医常以健脾祛湿为法进行治疗，疗效显著，苍术、白术为其中常用药物。苍术，为菊科植物茅苍术[Atractylodeslancea(Thunb.) DC.]或北苍术[Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.]的干燥根茎，中医认为，其味苦性温，具有燥湿化浊、升阳散郁之功效。[4]白术，为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎，中医认为，其味甘性温，具有益气健脾、燥湿和中之功效。[5]二者伍用，其燥湿健脾之功效更著，用于治疗寒湿内停之带下清稀，色白量多；脾胃不健，湿邪中阻之食欲不振，纳差呕吐，胸脘满闷；湿邪下注，水走肠间之腹胀，肠鸣，泄泻等症，方如苍术丸(《景岳全书》)。[6]

在六朝以前，古人用药不分苍术白术，统称为“术”。[7]陶弘景在《本草经集注》中首次明确提出“术乃有两种”，宋朝以后将术分为白术、苍术逐渐得到公认，李时珍在《本草纲目》中记载道：“自宋以为，始言苍术苦辛气烈，白术苦甘气和，各自施用，亦颇有理”。[6，8]苍术和白术在临床应用上的诸多异同也为历代医家所关注。历经多年临床应用，中医认为，苍术性味苦烈，长于燥湿，散多于补；白术则性味甘润温和，功擅健脾，补多于散。现代研究显示，两术虽同为菊科植物，但其中所含化学成分并不相同。苍术中主要含有倍半萜、烯炔、甾体类化合物，白术则主要含有挥发油、内酯、苷、多糖及氨基酸类化合物。两药均具有调节消化系统、免疫系统、心血管系统、神经系统等功能，还能够抗菌、抗炎、抗衰老及抗氧化。[9-10]本研究旨在从动物实验层面探讨苍术、白术在药理作用方面的差异及配伍的意义。

“久泻伤脾”“苦寒伤阳”，泻下药大黄、番泻叶等为味苦性寒之品，过服易损伤脾气，日久累及脾阳，造成脾失健运兼有虚寒，出现脾虚证候。在本项实验中，采取长期灌胃番泻叶水煎液的方法，复制了脾虚泄泻小鼠模型。造模后，可见小鼠出现腹泻、粪便稀溏、纳呆、精神萎靡、活动减少、体质量减轻等脾虚泄泻表现。胃肠运动功能紊乱是脾虚泄泻模型的重要特征之一，而胃肠激素水平变化是影响胃肠动力的重要因素。其中，MTL为小肠Mo细胞分泌的多肽，能够引起胃的收缩运动和小肠的分节运动，有利于胃肠的吐故纳新。[11]VIP的主要作用是松弛肠平滑肌和肛门内括约肌，并促进肠道水分和电解质的分泌。VIP分泌增多可引起胃肠运动功能紊乱，肠道分泌物增多，进而导致腹泻。[12]腹泻常伴随有消化道炎症反应，且二者呈正相关。[13]IL-1β和TNF-α均是由单核细胞分泌的经典促炎因子和早期致炎因子，可促进炎性细胞的激活与聚集，引发并放大肠黏膜炎性损伤。[14-15]AQPs是一类内在膜蛋白，又称水孔蛋白，其在细胞膜上组成孔道，通过控制细胞膜水分进出而调节肌体水代谢。结肠上表达的AQP3是调节消化系统水平衡的主要水通道蛋白之一，其表达量的高低决定着结肠黏膜对水分的吸收和转运，与腹泻的发生密切相关。[16-17]本项实验检测发现，与空白组小鼠相比，模型小鼠的胃残留率、血浆中MTL含量明显降低，小肠推进率、血浆VIP含量、结肠组织中IL-1β和TNF-α则明显升高，结肠AQP3 的蛋白表达水平显著降低。可见，脾虚泄泻模型小鼠，由于胃肠道运动功能异常、肠道炎症，消化道对水分的吸收能力降低，而出现粪便稀溏。

在本研究中，通过给与苍术、白术或两药的配伍组方，均能使脾虚泄泻小鼠的胃残留率提高，小肠推进率降低，减轻腹泻症状。其作用机制与提高血浆中MTL含量，降低血浆VIP、结肠组织中IL-1β和TNF-α含量，上调结肠AQP3 的蛋白表达水平有关。继续对两药及配伍方进行比较，可以发现，白术对调节胃肠激素水平的作用优于苍术，而苍术抑制炎症因子的释放和调节水通道蛋白的能力优于白术，与传统功效描述的苍术燥湿力胜，白术健脾力强相一致。而两药相伍，相得益彰，可使中焦得健。