Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株生产用种毒的鉴定

李来旭，潘添博，初晓红，李 睿

1.重庆永健生物制品有限公司，重庆 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆400000；3.江苏省新沂市畜牧兽医技术推广中心，江苏新沂 221400；4.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150000

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒（DHV）引起雏鸭的一种高度致死性的、传播迅速的病毒性传染病。临床上以神经症状、肝脏肿大及表面有出血为特点。该病潜伏期短，约为1 ～3 d 发病，传播速度快。Ⅰ型鸭肝炎病毒主要侵害30 日龄内的雏鸭，是危害养鸭业最严重的一种传染病之一。

本试验对重庆永健生物制品公司保存的Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株进行了毒种制备及病毒含量、鸡胚毒力、免疫原性、特异性和纯净性等一系列鉴定工作。检验结果均符合生产用种毒的要求，为企业提供生产用种毒奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株种毒

重庆永健生物制品公司保存备用。

1.1.2 其他材料和试剂

无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备；支原体培养基，购自北京中海生物科技有限公司；DMEM、新生牛血清，购自美国Hyclone公司购买。

1.2 方法

1.2.1 生产用种毒制备

将Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株毒种用生理盐水稀释至100 倍，经尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚，每胚0.2 mL，置37 ℃孵育观察120 h，弃去24 h 内死亡鸡胚，无菌收获36 ～120 h 死亡鸡胚尿囊液。

1.2.2 生产用种毒鉴定

1.2.2.1 病毒含量：将种毒作10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6 和10-74 个稀释度，经尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚各5 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃孵育观察120 h，24 h 前死亡鸡胚不计，记录鸡胚死亡情况，按Reed-Muench 法计算ELD50。

1.2.2.2 对鸡胚毒力：将种毒用生理盐水稀释至200 ELD50/0.2 mL，经尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚10 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃孵育，并记录鸡胚在接种后24 ～120 h 的死亡和剖检情况。

1.2.2.3 免疫原性：将病毒液经甲醛灭活与油佐剂乳化制成免疫原，肌肉接种SPF 产蛋鸡10 只，2.0 mL/只，同时设10 只SPF 产蛋鸡作为生理盐水对照。免疫后21 日采蛋，用中和试验方法进行卵黄抗体效价测定。

1.2.2.4 特异性：抽取待检样品，用生理盐水稀释至200 ELD50/0.2 mL，与等量Ⅰ型鸭肝炎病毒特异性阳性血清混合，置37 ℃水浴中和1 h，尿囊腔接种10 日龄SPF 鸡胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育观察120 h，记录24 ～120 h 鸡胚死亡情况。

1.2.2.5 常规检验：按照2015 版《中国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

2 结果

2.1 病毒含量测定结果

用SPF 鸡胚测定Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株生产用种毒的病毒含量，结果显示冻干毒对鸡胚的半数感染量为106.16/0.2 mL。

2.2 对鸡胚测定结果

Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株生产用种毒冻干毒接种鸡胚，可致鸡胚10/10 死亡，剖检死亡鸡胚，胚体出血，肝脏出血，说明毒力稳定。

2.3 免疫原性测定结果

生产用种毒接种鸡胚制备的病毒液灭活后与油佐剂乳化制成免疫原，肌肉接种产蛋鸡，免疫后2 1 日采蛋测定卵黄抗体中和效价平均值为1:325，对照组卵黄抗体效价为1:2，免疫原性良好。

2.4 特异性检验结果

特异性检验结果表明CRF98 株生产用种毒可被Ⅰ型鸭肝炎病毒特异性阳性血清完全中和，特异。

2.5 无菌检验结果

无菌检验结果表明CRF98 株生产用种毒无细菌生长。

2.6 支原体检验结果

支原体检验结果表明CRF98 株生产用种毒无支原体生长。

3 讨论

我们对Ⅰ型鸭肝炎病毒CRF98 株生产用种毒进行鸡胚传代扩繁。经病毒含量、鸡胚毒力、特异性、免疫原性、纯净等鉴定，表明该病毒传代稳定，病毒含量达到要求，免疫原性较高，能够被同型特异性阳性血清中和，无细菌和支原体污染。为疫苗生产提供了能长期保存且稳定性好、高滴度的生产用种毒。