宿主细胞因子在抵抗隐孢子虫感染过程中的作用

张亚军，谢福杰，胡苏辉，张素梅，张龙现，王荣军

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450046)

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种寄生于细胞内的人兽共患性原虫，是仅次于轮状病毒的可导致儿童腹泻和死亡的第二大病原[1]，在5岁以下儿童死亡病因中，因隐孢子虫病导致的死亡约占12%[2]。到目前为止，已知约有20种不同的隐孢子虫可引起人类中度甚至重度感染，其中人隐孢子虫和微小隐孢子虫是主要的病原[3]。隐孢子虫病呈世界范围广泛流行，主要感染胃肠道、胆道，偶尔也可感染人类和动物的呼吸道上皮[4]。腹泻是隐孢子虫病的典型临床特征；在免疫功能正常的个体中，腹泻通常呈现自限性；而在婴幼儿、免疫功能低下或障碍个体(如艾滋病患者)中，常发生持续性腹泻，导致脱水、营养不良，甚至死亡；这些都表明机体免疫系统对于控制隐孢子虫感染和清除隐孢子虫有至关重要的作用[5-6]。体外和体内试验结果显示，固有免疫和获得性免疫均参与宿主抵抗隐孢子虫的感染过程[7-8]。因此，充分研究隐孢子虫感染后宿主与寄生虫的相互作用及宿主对隐孢子虫的免疫反应，对于预防、诊断和开发有效治疗药物具有重要意义。

细胞因子作为免疫系统的重要组成部分，在宿主抗隐孢子虫感染过程中发挥重要作用。目前,研究发现宿主细胞分泌的白细胞介素(interleukin,IL)、干扰素(interferon,IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和转化生长因子-β家族(transforming growth factor-β family,TGF-β family)参与感染早期抑制隐孢子虫的入侵，感染后免疫系统的激活，刺激免疫细胞活化、增殖、分化和移行以及免疫细胞和肠上皮细胞清除寄生虫等一系列生物学过程[9]。现综述白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子等细胞因子在抵抗隐孢子虫感染过程中的功能以及作用机制。

1 白细胞介素(interleukin，IL)

1.1 IL-4IL-4是Th2型细胞因子。在人和小鼠感染微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum，C.parvum)后，在感染的各个阶段均可检测到IL-4 mRNA和蛋白的表达。在小鼠和人体内，T细胞清除C.parvum需要表达γ干扰素(IFN-γ)[10]，多个研究表明IL-4抗C.parvum的作用与IFN-γ密切相关。STUAR首次报道了Th型细胞因子IL-4在C.parvum感染小鼠的早期起限制作用；在感染前用抗IL-4中和抗体或重组IL-4处理野生型(wildtype，wt)小鼠，可分别增加或减少卵囊产出，表明宿主IL-4在C.parvum感染早期阶段发挥保护性作用。在MCDONALD等[11]研究中，与正常小鼠相比IFN-γ缺陷小鼠排出的卵囊不受抗IL-4处理的影响，而wt小鼠中肠道IFN-γ和IL-12 mRNA的水平在感染早期比IL-4缺陷小鼠中更高，这表明IL-4直接或间接促进IFN-γ的表达，进而增强机体的抗寄生虫作用。而另外一项体外研究表明,IL-4在感染的晚期可与低浓度IFN-γ协同作用，刺激肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)清除C.parvum，这种现象能保持在感染的后期IEC对寄生虫的有效灭活[12]。

1.2 IL-12宿主抗C.parvum感染主要与细胞介导的Th-1免疫应答和2种重要细胞因子IFN-γ和IL-12的产生有关[13]。有研究表明，IFN-γ在针对C.parvum感染的宿主保护性免疫应答中是必需的[14]，而IL-12是IFN-γ的诱导者[15]。这种细胞因子刺激NK和CD4+细胞产生IFN-γ，随后产生的IL-12与活化细胞的IFN-γ联合，导致Th-1细胞分化并产生高水平的IFN-γ。IL-12在感染开始时是必不可少的，但在C.parvum持续感染时产生高水平的IFN-γ并不需要IL-12[16]。宿主对C.parvum感染的抗性取决于IL-12的产生，试验证明C.parvum卵囊感染前1 d用IL-12处理免疫活性或免疫缺陷的新生小鼠可防止感染的发生。C.parvum感染的严重程度受到内源性IL-12的限制，因为用IL-12抗体处理会加剧C.parvum的感染。此外，在感染1 d后用外源IL-12处理C.parvum感染的小鼠，尽管不能阻止C.parvum感染，但检测到C.parvum感染强度减弱。事实上，IL-12限制C.parvum感染的能力可能是由于杀死裂殖子所致。外源性IL-12不能清除已经建立的C.parvum感染，表明该细胞因子的使用是预防性的[17]。由于C.parvum寄生部位局限在胃肠道上皮，可以通过在肠黏膜上外源性加入IL-12来预防C.parvum的感染，而不引起全身性毒性。另外，由于IL-12产生缺陷导致内源性IL-12无法表达的C.parvum易感患者也可通过使用外源性IL-12控制C.parvum感染。

1.3 IL-17有研究显示，IL-17及其家族成员在抗多种原生动物感染过程中发挥重要作用[18]。C.parvum感染过程中，通过引起绒毛中的肠细胞损失致使绒毛萎缩，导致肠上皮细胞收缩来维持连续的上皮屏障。随着肠细胞的丢失，肠绒毛逐渐变短，最终引起腹泻[19]。肠上皮细胞丢失是C.parvum导致腹泻的重要原因，有研究证实，IL-17可减轻C.parvum对宿主上皮细胞的损伤。DRINKALL等[20]在牛肠道模型中研究发现，IL-17在C.parvum感染后迅速上升，同时能减轻由C.parvum导致的宿主细胞损伤。

1.4 IL-18IL-18是由肠上皮细胞、巨噬细胞和树突细胞表达的促炎细胞因子[21]。体内外研究表明，IL-18在限制C.parvum感染中起关键作用[22]。BEDI等[23]使用SCID小鼠研究发现,减少IL-18的表达可显著增加C.parvum感染强度，而用重组IL-18处理可显著降低寄生虫感染强度。另一研究显示，用抗IL-18抗体处理后的小鼠其肠道IFN-γ水平降低，C.parvum感染强度增加，表明IL-18对于IFN-γ的表达是必需的。MCDONALD等[24]研究表明，IL-18也可通过刺激IEC增加抗菌活性来介导其保护作用。BEDI等[23]研究显示，用重组IL-18处理的小鼠其小肠组织中抗微生物肽和β防御素3的mRNA表达显著增加。IL-18可通过不同途径介导其C.parvum作用，如通过IFN-γ诱导或直接刺激肠上皮细胞，以增加抗菌活性，进而抵抗C.parvum感染。

2 干扰素(interferon，IFN)

IFN分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，Ⅰ型IFN包括α和β，Ⅱ型IFN包括γ。

2.1 Ⅰ型IFNⅠ型IFN在C.parvum感染早期由感染的肠细胞和树突状细胞产生，并且参与抗C.parvum感染的保护性先天性免疫反应，直接抑制C.parvum的发育，并且Ⅰ型IFN不依赖于IFN-γ[25]。目前，IFN-α/β如何在感染的肠细胞中被诱导、表达尚不清楚，但可能涉及Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)。Ⅰ型IFN表达可以通过大多数TLR(如TLR4)的信号传导而被激活，并且显示该病原体的识别受体在寄生虫附着或侵入肠细胞表面上累积并参与启动受感染细胞的炎症反应。据报道，TLRs对C.parvum具有免疫作用：给新生的小鼠口服未甲基化的CpG寡核苷酸(TLR9的配体)刺激了对感染的强烈抵抗[26]，髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88,TLR信号传导中的衔接蛋白)缺失小鼠比野生型小鼠更容易受到感染[27]。IFN-α/β对C.parvum的清除作用，可能涉及NK细胞对已感染细胞的溶解作用[28]。

2.2 Ⅱ型IFN有研究表明，IFN-γ能直接诱导肠上皮细胞对C.parvum感染的抵抗力，抑制C.parvum在细胞内的发育。POLLOK等[29]利用HT-29、Caco-2、H4等3种细胞系研究IFN-γ对C.parvum感染的影响，发现在感染前24～72 h或接种后2 h，在HT-29和Caco-2细胞系中加入IFN-γ，可显著抑制C.parvum感染，其中在HT-29细胞中的抑制效果最强，在Caco-2细胞中观察到的抑制效果较弱，但在H4细中IFN-γ对C.parvum感染没有抑制作用。通过进一步对细胞中IFN-γ受体表达情况进行研究发现，3种细胞系中IFN-γ受体表达量不同是造成这种抑制效果差异的原因。在3种细胞系中，IFN-γ受体在HT-69细胞中表达最高，Caco-2细胞中表达次之，而在H4细胞中则没有检测到IFN-γ受体的表达。IFN-γ不能抑制H4细胞中C.parvum的感染，排除了IFN-γ对寄生虫的直接抑制作用，间接证明了IFN-γ受体的表达在IFN-γ介导的抑制寄生虫感染中起关键作用，并且可以解释为什么IFN-γ介导的寄生虫抑制在HT-29细胞中更有效。IFN-γ通过结合IFN-γR，导致JAK2激活STAT1a，在细胞水平抑制寄生虫感染。通过加入JAK2特异性抑制剂tyrphostin B42减轻IFN-γ对寄生虫感染的抑制，进一步证明了IFN-γR可在肠上皮细胞抑制C.parvum感染。该研究还发现IFN-γ的抑制作用发生在C.parvum入侵和细胞内发育这2个阶段，但IFN-γ的抑制作用在C.parvum发育阶段强于入侵阶段。这可能与细胞内的Fe2+浓度有关；IFN-γ介导的寄生虫感染抑制作用随着外源性FeSO4剂量的降低而升高。此外，有研究表明肠黏膜中IFN-γ的产生也与寄生虫感染后的宿主恢复有关[30]。

3 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)

TNF-α是可由上皮细胞和单核细胞产生的一种炎性细胞因子，通常在炎症中起关键作用，并且可以参与针对细胞内感染的免疫保护机制[31]。在感染C.parvum的人的肠中观察到TNF-α水平升高。另外，C.parvum感染异种移植到SCID小鼠中的肠道观察到TNF-α的表达[32]。体外研究表明，TNF-α可以抑制人肠上皮细胞系HT-29细胞的C.parvum感染。动物实验显示，受C.parvum感染的IFN-γ缺陷BALB/c小鼠，其脾细胞的TNF-α表达在感染期间增加[33]；使用TNF-α处理IFN-γ缺陷B.6小鼠可减轻感染[34]；这表明TNF-α可能参与控制C.parvum感染的免疫机制。另外一项研究表明，TNF-α可通过阻止C.parvum侵袭宿主细胞来抑制C.parvum在肠上皮细胞的繁殖[35]，但缺乏TNF-α不会增加宿主对C.parvum的易感性；IFN-γ相关的免疫机制并不需要TNF-α的存在，在不涉及TNF-α的情况下仍可实现对宿主中C.parvum感染的清除[36]。

研究表明，TNF-α还可能与C.parvum感染导致的腹泻相关。KANDIL等[37]认为TNF-α是猪C.parvum病腹泻的主要因素。THIBAUT等[35]的研究也支持这种观点，并指出新生小鼠在感染C.parvum期间，聚集的大量炎性单核细胞产生的TNF-α可能破坏了上皮细胞间的紧密连接，导致肠道通透性增加。因此，在免疫正常的个体中通过抑制TNF-α减轻肠道症状，可能会成为一种减轻腹泻症状的免疫疗法。此外，ROBINSON等[38]对患有C.parvum病志愿者的空肠进行检测表明，TNF-α在人体内的表达与C.parvum的感染相关，而与肠道症状无关。这可能与不同年龄阶段的宿主免疫反应不同有关。

4 转化生长因子-β家族(transforming growth factor-β family，TGF-β family)

TGF-β是一种重要的宿主免疫和炎症反应的调节剂，在感染C.parvum并且有症状的志愿者的空肠黏膜中观察到TGF-β1的表达增加[39]。当用C.parvum感染人结肠癌细胞系Caco-2时，Caco-2肠细胞本身可以在体外分泌TGF-β[40]，表明这种细胞因子的潜在重要来源是肠细胞。TGF-β不能影响寄生虫活性，但能抑制由C.parvum感染诱导的上皮细胞的损伤。外源性TGF-β通过诱导肠上皮细胞中的蛋白激酶C途径，可显著降低细胞的通透性并减少由C.parvum引起的细胞坏死，在体外具有保护上皮细胞单层的屏障功能[41]。LEAN等[36]研究表明，TGF-β通过抑制IFN-γ从而抑制肠上皮细胞对C.parvum发育的抑制作用，这是因为TGF-β具有抗炎作用。

5 结语

宿主肠上皮细胞以及免疫细胞分泌的细胞因子，在抗C.parvum入侵以及清除虫体的过程中具有重要作用。然而，细胞因子与肠上皮细胞、机体免疫系统之间的相互作用机制尚不清楚。已有研究表明，一些细胞因子如IFN-γ和IL-12是宿主抗C.parvum感染的必需因子；IL-4和IL-18等是非必需因子，但能增强上皮细胞的抗感染能力；IL-17和TGF-β等细胞因子能够减轻C.parvum导致的腹泻症状。目前，尚未有用于治疗C.parvum病的特效药物，因此研究细胞因子在宿主抗C.parvum感染过程中的作用机制对于开发免疫疗法具有重要意义。