miRNA在奶牛乳腺炎疾病中的研究进展

李 婷,尹伊娅,唐 鑫,张文劲,李雨芮，陈颖钰,2,郭爱珍,2,胡长敏*

(1.华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

奶牛乳腺炎是一种常见的奶牛疾病，多发而且病因复杂，除饲养管理不良或遗传因素外，其他多种病原微生物也会引起该病，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌及支原体等，给养牛业造成了巨大的经济损失[1]。miRNA作为小的非编码RNA，与mRNA结合，从而抑制蛋白的翻译或者引起mRNA的降解，参与细胞生长、分化、增殖以及凋亡等多种生物学功能。近年来，研究者们对牛乳腺炎中的miRNA进行深度测序，发现miRNA与牛乳腺炎疾病密不可分。研究证实,测序得到的大多数关键miRNA参与细胞发育以及先天和获得性免疫反应[2]。

1 miRNA简介

miRNA是一类内源性的长度在22 nt左右的非编码小RNA。1993年，人们首次[3]在线虫中发现miRNA，随后对其作了深入的研究，发现miRNA能够在真核生物体内广泛表达，通过与mRNA上的某些碱基互补配对，从而在转录后水平调节生物学功能[4]。

1.1 miRNA的生物合成过程在动物体内，miRNA的生物合成过程主要如下：细胞核内，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录成长度约为几百个到几千个nt的miRNA初级转录产物(pri-miRNA)，再经过核糖核酸内切酶Ⅲ酶Drosha和DGCR8识别和切割，形成含有约70 nt发夹结构的miRNA前体(pre-miRNA)[5-7]。Pre-miRNA通过Expertin-5从细胞核输出到细胞质中[8]，再通过Dicer酶的切割生成短的双链结构，并与AGO2蛋白结合形成复合体前体，然后双链解开形成成熟的单链miRNA，最终形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。但是,双链结构在RISC复合体中解链成单链的原因目前尚不可知。

1.2 miRNA的功能机制miRNA可以调控多个生命活动，如细胞的生长、增殖分化、衰老及凋亡等。研究表明,一种miRNA可以调控多种mRNA的表达，同时一种mRNA也可能受到多种miRNA的调节，从而形成一个复杂的调控网络。miRNA 5′末端的6～8 nt序列通常是高度保守的“种子”序列[9-10]，主要与mRNA的3′UTR区结合[11]，从而阻止mRNA的翻译，影响蛋白的表达，这一过程主要在细胞质中完成。近年来，miRNA的其他作用模式逐渐被发现，例如成熟的miRNA在细胞核内调控其他非编码RNA的前体[12-13]、通过5′UTR区调控基因[14]以及对DNA进行甲基化修饰[15]等。

2 miRNA在不同牛乳腺炎模型中的表达谱

近年来，miRNA在奶牛疾病的相关研究中进展迅速，研究者利用高通量测序、生物信息学以及GO(GeneOntology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能分析等方法对奶牛乳腺炎进行分析，并不断探究miRNA分子的功能。

2.1 miRNA在牛乳腺炎体外模型中的表达研究者使用二代测序方法，检测了多个时间点内乳房链球菌感染牛原代乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BME)的miRNA表达，发现有大约20%已知的牛miRNA在BME中表达，并有21种差异表达的miRNA，部分miRNA已经被证实与免疫反应密切相关[16]。研究还通过文献调查结合试验鉴定了LPS刺激细胞后的145种miRNA的表达，发现LPS的刺激结果与测序结果存在差异。这一现象意味着LPS刺激乳腺上皮细胞的体外模型不能够完全替代细菌感染的乳腺炎过程，同时大多数miRNA的表达在感染后的不同时间点内存在差异，暗示miRNA可能对基因表达存在微调[17]。这些现象也被另一项研究所证实，该研究通过在不同时间点分别用灭活的大肠杆菌/金黄色葡萄球菌作用于牛乳腺上皮细胞系MAC-T细胞，发现不同刺激条件(不同的病原菌或不同刺激时间)对miRNA的表达谱均存在差异[18]。上述研究均对高表达和差异表达的miRNA进行了GO富集分析和KEGG功能分析，进一步证实乳腺上皮细胞参与对感染性乳腺炎的免疫反应，也证实miRNA参与乳腺炎的发展过程，同时给后续研究提供了数据支持。

2.2 miRNA在乳腺炎体内模型中的表达与乳腺炎的体内模型相比，上述文献所采用的体外模型影响因素相对单一。牛组织中的免疫细胞也参与乳腺炎症反应过程的调节，因此单独对牛乳腺上皮细胞研究并不能完全揭示乳腺感染的分子机制。乳腺炎的体内模型数据研究，能更加充分地说明miRNA在牛乳腺炎中的调节机制。有研究比较了健康和感染金黄色葡萄球菌的乳腺组织中的miRNA的表达，发现了77个表达差异的miRNA，其中10种得到验证，并对研究结果进行了GO富集分析和KEGG功能分析[19]。此外发现验证的miR-223上调结果与另一项研究[20]的结果相反，对于miR-223在乳腺上皮细胞中的生物学功能和作用，研究者可以更深入地分析，阐明miR-223在奶牛乳腺炎中的调节机制，找出这种差异存在的原因。此后，又有学者[21]为了检测miRNA在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染的牛乳腺中的差异，对组织样本进行了测序，结果显示与对照组相比，金黄色葡萄球菌感染的相关差异miRNA中，有186个上调和93个下调，大肠杆菌感染的差异表达的miRNA有243个上调和62个下调。体内感染模型研究中对miRNA的GO富集分析和KEGG功能分析表明，miRNA具有在乳腺炎症调节中的作用以及其在免疫相关基因调控网络中的多重作用。

2.3 miRNA在乳腺炎自然感染病例中的表达相对于人工感染致牛乳腺炎模型，有研究人员[22]对自然感染金黄色葡萄球菌的晚期牛乳腺炎组织进行测序，发现了29个差异表达的miRNA，并进行GO富集分析和KEGG功能分析发现，这些miRNA对免疫、炎症、防御、细胞增殖、细胞凋亡以及组织损伤与修复有着重要意义，另外研究者还证实了其中的bta-miR-26a在乳腺炎中的下调是通过增强靶基因FGA表达介导的。

除了对乳腺组织进行测序研究外，开展乳腺炎感染期间外周血中miRNA、牛奶中miRNA的研究也同样重要。有研究[23]利用Solexa测序方法对自然感染牛乳腺炎的外周血进行miRNA表达谱分析，鉴定出173种差异表达的miRNA，其中118个miRNA参与了免疫应答的信号传导途径，高表达的miRNA如miR-25[24]、miR-486[25]、miR-339b[26]等已被证实在其他疾病中发挥着重要作用。另外对由金黄色葡萄球菌感染引起乳腺炎的牛乳外泌体[27]进行miRNA测序，发现14种已知的牛miRNA在感染和对照动物的外泌体之间存在差异，并鉴定了6种miRNA在外泌体中的表达，推测bta-miR-142a和bta-miR-223可作为细菌感染的生物标志物。上述研究使miRNA在牛乳腺炎中的研究更加丰富和全面，同时也进一步证实miRNA在牛乳腺炎疾病中的重要作用。

3 miRNA与牛乳腺炎的调控关系

研究者利用高通量测序或芯片技术筛选出众多关键的miRNA，借助生物信息学预测其靶基因并进行GO功能富集和KEGG通路分析，发现这些miRNA可能参与各种免疫信号通路的调节，包括TLR(Toll-like receptors)信号通路、MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号通路、TGF-β信号通路、趋化因子信号通路等众多与乳腺炎疾病相关的信号通路，从而影响其免疫、炎症、防御、细胞增殖和细胞凋亡以及组织损伤和修复等。相关测序报道中的关键miRNA包括miR-146a、miR-193a、miR-23a、miR-184、miR-423-5p、miR-92a、miR-148a、miR-21-3p、miR-29b、miR-26a、miR-223、miR-132、miR-1246、miR-130b、miR-196a、miR-200b、miR-31、miR-145等，其中很多miRNA已经在之前或是之后的研究中被证实可以调控某些关键的信号通路。

3.1 miRNA介导TLR信号通路Toll样受体(TLRs)的主要功能是识别病原体配体，在天然免疫及获得性免疫应答中进行信号转导，因此在奶牛乳腺炎疾病中发挥着重要作用[28]。通过研究发现，miR-146a在乳腺炎中显著上调[29]。miR-146a已经被证实可以和靶基因TRAF6[30]作用，从而调节TLR4/NF-κB信号通路[31]。miR-21能负调节靶基因TLR4[32]。除这2种miRNA外，还有如miR-223[33]、miR-23a[34]等多个miRNA也被报道可以调节TLR4或是NF-κB信号通路，这意味着miRNA对乳腺炎存在较为复杂的调控机制。

3.2 miRNA介导MAPK信号通路丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在牛乳腺炎中起着重要的作用。MAPK信号转导通路通过三级激酶级联反应传递信号：细胞外刺激使MKKK(MAP kinase kinase kinase)激活，然后激活MKK(MAP kinase kinase)，最后对苏氨酸和酪氨酸双位点磷酸化激活MAPK，MAPK被激活后，可调节细胞骨架相关蛋白、磷酸化转录因子、酶类等细胞功能[35]。调节MAPK的miRNA众多，如miR-23a[36]、miR-148a[37]、miR-193a-3p[38]等。相较于正常的牛健康组织，这些miRNA在牛乳腺炎组织中差异表达，暗示着这些miRNA可能通过MAPK信号通路来对牛乳腺炎进行调控作用。

3.3 miRNA介导的细胞凋亡众所周知，一个miRNA可以调控多个靶基因，多个miRNA也可以调控一个靶基因，从而形成一个复杂的调控网络。miR-21[39]、miR-146a[40]除了能调控TLR4外，也能作用于BCL-2，增加细胞的凋亡。细胞凋亡可抑制炎性因子的表达，从而主动抑制炎症反应的发生。细胞凋亡是乳腺炎疾病过程中存在的重要途径，miR-30b、miR-23a[41]、miR-29[42]等测序研究中的多个关键miRNA分子在其他研究中均证实参与了细胞凋亡的调节，意味着miRNA可以通过对凋亡途径的调控来调节乳腺炎疾病的发生和发展。

4 结论与展望

miRNA在奶牛乳腺炎疾病中有着举足轻重的作用，不论是先天性免疫，还是获得性免疫，miRNA能够通过相应的调节机制参与乳腺炎疾病的发生和发展过程。综合测序和miRNA机制研究，证明miRNA具有作为牛乳腺炎的生物标志物的潜力。但现有研究对于miRNA在牛乳腺炎疾病中的作用尚不够深入，需要进一步的探索与发现。相信随着科学技术的进步，在未来miRNA能够作为诊断和治疗牛乳腺炎的一种新的思路和方法。