液相芯片技术与实时荧光定量PCR在检测儿童感染性腹泻病原体的比较

汉聪慧，曹广进，张福真，胡亮杉，曹东林*，李 凌*

(1.南方医科大学 公共卫生学院 三级生物安全实验室，广东 广州 510515； 2.广州市番禺区疾病预防控制中心，广东 广州 511400; 3.广东省第二人民医院 临床检验中心，广东 广州 510317)

感染性腹泻广义指各种病原体肠道感染引起的腹泻，除外霍乱、细菌性和阿米巴痢疾、伤寒和副伤寒的感染性腹泻[1]。据估计，2016年全球共有40亿感染性腹泻患者，其中160万患者死亡。发展中国家的儿童最容易受到影响[2-3]。截至2017年，约53万名5岁以下儿童因腹泻而死亡[4]，其中大部分发生在世界上最贫穷的国家。国家卫生健康委员会公布，2018年中国感染性腹泻病发病率为92/10万，病死率为0.001/10万。

多种细菌、病毒均可引起感染性腹泻病，且存在2种或2种以上的病毒或(和)细菌混合感染的情况[5]。研究表明，一年内中国5岁以下儿童出现腹泻病原体的混合感染可达到27.60%[5]。腹泻病患者数量大、病原体复杂且多混合感染，目前中国肠道门诊常规检测包括的感染性腹泻病原体种类有限，特殊检测周期长，存在一定的局限性。液相芯片具有高通量、快速、可靠和经济等特点，可实现临床快速确诊[6]。因此，本研究运用液相芯片技术快速检测感染性腹泻病病原体，分析检出病原体特征，并与实时荧光定量PCR比较，评价其在感染性腹泻病快速诊断中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源：粪便样品来自于2017年11月至12月广东省第二人民医院门诊就医的96例儿童及0月～5岁婴幼儿腹泻患者，其中男性54例、女性42例，年龄中位数为2.05岁。就诊前患儿未服用抗生素、抗病毒及抗阿米巴药物。本研究获得医院伦理委员会批准(批准文号：2017-SCZYF-JYK)。

1.1.2 试剂：胃肠道病原体检测试剂盒(Luminex公司)；核酸抽提试剂盒(Qiagen公司)；样品预处理缓冲液(Biomerieux公司)；Bertin SK38粪便核酸提取微珠试管(Bertin公司)；质粒小提试剂盒、切胶回收试剂盒、pMD 19-T载体及氨苄青霉素(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 粪便标本的预处理：将100～150 mg粪便样品添加到含Bertin SK38微珠的粪便样品裂解液中。每份样品加入10 μL的xTAG®MS2作为液相芯片检测的内参对照。将预处理试管涡旋5 min，室温下静置10～15 min，再以14 000 r/min离心2 min，得到样品上清液。

1.2.2 核酸的提取：取200 μL的样品上清液，按照核酸抽提试剂盒说明书进行操作，最终得到60 μL核酸洗脱液。

1.2.3 液相芯片检测

1.2.3.1 多重RT-PCR反应：每个反应管中加入xTAG®RNase-free水2.5 μL、5×xTAG®OneStep RT-PCR缓冲液7.5 μL、xTAG®GPP 引物混合物2.5 μL、xTAG®BSA(10 mg/mL)0.5 μL和xTAG®OneStep 酶混合物2.0 μL，共15 μL，配制96例样品所需试剂量，同时设置阴性对照。再加入96例样品核酸洗脱液10 μL/管，阴性对照中加入xTAG®RNase-free水10 μL。将配好的各PCR管短暂离心。在PCR仪中以53 ℃ 20 min，1个循环；95 ℃ 15 min，1个循环；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，38个循环；72 ℃ 2 min，1个循环，进行多重RT-PCR反应。

1.2.3.2 多重PCR产物与微球杂交反应：在每个0.2 mL PCR管中加入xTAG®GPP Bead Mix 20 μL、1×SA-PE报告溶液75 μL、多重RT-PCR产物5 μL，配制成100 μL/管的杂交体系。最后，在提前预热至60 ℃的PCR仪中以60 ℃ 3 min、45 ℃ 45 min进行分子杂交反应。

1.2.3.3 xTAG®GPP检测：将PCR管放置于提前预热至45 ℃的加热器，检测后使用xTAG®Data Analysis Software (TDAS) 软件分析结果。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测：采用实时荧光定量PCR试剂盒(探针法)对1.2.2步骤所提取的核酸进行qPCR。qPCR检测所用引物序列(表1)[7]，所用基因探针序列(表2)[7]。

1.2.5 多重PCR产物的克隆、测序分析：将多重PCR产物克隆到pMD19-T载体，转化、挑取单菌落、扩大培养、进行菌液PCR、琼脂糖凝胶电泳验证，最后提取菌液质粒送至公司进行测序、BLAST分析。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primer sequence of real-time PCR

表2 实时荧光定量PCR探针序列Table 2 Gene probe sequence of real-time PCR

1.3 统计学分析

计数资料以例数n、百分率(%)表示，采用SPSS 20.0对液相芯片与实时荧光定量PCR的检测结果进行配对计数资料的χ2检验，以敏感度和特异度、阴性预测值和阳性预测值为检测指标。

2 结果

2.1 腹泻病原体检出情况

xTAG®GPP试剂盒共检出7种病原体63例，阳性检出率为65.63%(63/96)。其中检出最多的是沙门氏菌48例(50.00%)，其次是空肠弯曲杆菌20例(20.83%)、A组轮状病毒16例(16.67%)、诺如病毒14例(14.58%)、肠道腺病毒3例(3.13%)，产肠毒素型大肠杆菌和大肠杆菌O157均为2例(2.08%)，没有检出霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森杆菌及志贺氏菌。实时荧光定量PCR检出62例样品为阳性，阳性检出率为64.58%(62/96)。

2.2 两种方法检测结果的比较

4种病原体(包括沙门氏菌、A组轮状病毒、诺如病毒和空肠弯曲杆菌)检出率均有差异(P<0.05)；液相芯片检测7种腹泻病原体的敏感度、特异度、阴性预测值、阳性预测值(表3)；正确指数为82.76～97.62，表明液相芯片检测腹泻病原体的真实性较高。

表3 液相芯片和实时荧光定量PCR方法对每种肠道病原体检测结果比较Table 3 Comparison of liquid-phase chip and real-time PCR method for detection of each intestinal pathogen

-.no data;p.positive;n.negative.

液相芯片与实时荧光定量PCR检测结果相同的共有83例，一致率为86.46%(83/96)，其中真阴性占39.76%(33/83)，真阳性占60.24%(50/83)。对沙门氏菌、A组轮状病毒、诺如病毒和空肠弯曲杆菌的kappa值分别为0.79、0.83、0.92和0.91，说明两种方法的一致性好。

经χ2检验分析可知，与实时荧光定量PCR相比，液相芯片检测感染性腹泻病原体的敏感度为100.00%，特异度为71.74%，阴性预测值和阳性预测值分别为100.00%和79.37% (χ2=53.73，P<0.05)。

2.3 混合感染检出情况

在96例样品中，液相芯片与实时荧光定量PCR检出只感染一种病原体的样品例数(百分率)分别为38例(39.58%)、39例(40.63%)，混合感染例数及病原体检出种类见表4。液相芯片检出的细菌混合感染为7例(7.29%)，病毒混合感染为1例(1.04%)，细菌病毒混合感染为17例(17.71%)；实时荧光定量PCR检出的细菌混合感染为7例(7.29%)，病毒混合感染为1例(1.04%)，细菌病毒混合感染为15例(15.63%)。

3 讨论

感染性腹泻是全球的重要公共卫生问题[8]。

表4 两种方法对混合感染检测效果Table 4 Detection of mixed infection by two methods

多种病原体如细菌、病毒和寄生虫都能引起腹泻，在发展中国家，沙门氏菌感染致腹泻是儿童死亡的主要原因之一[9]。

本研究运用液相芯片对7种细菌和3种病毒进行快速、平行检测，结果发现患儿腹泻中细菌性感染较多，这可能与区域季节性的细菌性流行相关[10]。腹泻患儿粪便中沙门氏菌检出率高达半数，这与报道结果[11]类似；其次为空肠弯曲菌，该厌氧菌对营养要求较高，临床常规方法如细菌培养、生化鉴定等，耗时长达1周，因此，液相芯片技术对以空肠弯曲菌为代表的肠道厌氧菌的检测极具优势[12]。本研究病毒性感染以A组轮状病毒最多，其次为诺如病毒和肠道腺病毒，这与国内报道的感染情况[13-14]一致。上述结果表明，液相芯片技术可有效用于感染性腹泻病原体的快速检测。

腹泻病原体混合感染较常见。本研究液相芯片检测出多种细菌或病毒或细菌和病毒的混合感染，其中沙门氏菌、空肠弯曲菌两种细菌混合感染比例最高达72.00%(18/25)，这与报道的细菌性混合感染病原体类型相似[10]。面对混合感染时，实时荧光定量PCR不仅耗费大量的人力、物力，还可能会因病原体种类较多而延误最佳治疗时机，而液相芯片一次能检测多种病原体，这对混合感染的腹泻病的快速诊断具有重要意义。

本研究中同一份样品用两种方法检出的一致率较高，且液相芯片的敏感度和特异度与报道结果[12]相似。对不一致样品进行测序分析，结果显示与qPCR检出结果一致，表明液相芯片检测中出现了1～3个病原体的误检。液相芯片的假阳性可能与产物的切胶回收、克隆等操作有关，或因上次扩增产物密闭不严致所用试剂、加样枪、环境出现极微量或微量的非目的核酸污染。可采取的措施包括阴性对照的设置，试剂、加样枪和环境的预处理和分区操作等，实现腹泻病原体的准确检测。

综上所述，无论是单一腹泻病原体感染还是混合感染，与qPCR相比，液相芯片技术都显示出了高通量、快速、准确的优势。液相芯片技术对临床快速检测腹泻病原体具有积极意义。