miR-451通过Akt负向调控糖尿病肾病患者组织上皮间质转分化

2020-04-18郭红宝刘友霞贾俊亚闫铁昆

基础医学与临床 2020年4期

郭红宝，刘友霞，贾俊亚，闫铁昆

(天津医科大学总医院肾脏内科，天津 300052)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其在胚胎发育、组织分化、细胞增殖、侵袭和凋亡等多种过程中发挥重要作用，并参与了糖尿病肾病的关键基因的表达[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的且严重的微血管并发症之一，是慢性肾功能衰竭的主要病因，最终导致肾小球硬化和间质纤维化[2]。高血糖是糖尿病肾病最主要致病因素之一，诱导肾小管上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)加速肾脏纤维化是DN发病的潜在机制之一。笔者前期研究表明miR-451对糖尿病肾病早期具有预防和保护作用，Akt是miR-451的作用靶点[3]，其基因在肿瘤中通过各种信号通路促进上皮间质转化，加速恶性肿瘤侵袭和迁移；而糖尿病肾病中曲格列酮通过PI3K/Akt信号通路失活葡萄糖转运蛋白，延缓肾小管上皮间质转化的发生[4]。有效延缓或阻断肾小球硬化和间质纤维化的进程是防治DN的关键。本文研究miR-451对糖尿病患者肾脏组织EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

miR-451、U6小RNA、Akt、E-钙黏素、vimentin、α-SMA和GAPDH引物及定量PCR标准化试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)；反转录试剂盒(Promega公司)；转染试剂(Roche公司)；Trizol试剂(Invitrogn公司)；兔抗Akt、vimentin、α-SMA和E-钙黏素一抗(Santa Cruz公司)；鼠抗GAPDH一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗、苏木精、伊红、一抗稀释液、生物素标记的组化二抗、辣根酶标记的卵白素三抗、DAB显色试剂盒和中性树胶等试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)；PVDF膜(Amersham Life Sciences公司)；ECL检测试剂盒(Pierce公司)；其余为国产分析纯试剂。

1.2 分组及组织来源

分为正常肾脏组织组(normal kidney tissue，NKT)和糖尿病肾病组织组。选取Ⅳ期，即临床糖尿病肾病期(diabetic nephrotic kidney tissue，DNKT)。两组肾脏组织均来源于外伤后泌尿外科术后破碎组织，并经天津医科大学总医院肾科病理实验室诊断。此研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准(伦理字201110号)，患者签署知情同意书。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测miR-451、Akt和EMT相关基因的表达：提取各组组织的总RNA，并反转录成cDNA，分别用miR-451(5′-GCGGCGCAAAGAATTCTCCT-3′，5′-GGAACGC TTCACGAATTTG-3′)、U6(5′-ATTGGAACGATACA GAGAAGATT-3′，5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′)、Akt(5′ -AGGACTGTAGGAGTGGACGATGGTGG-3′，5′-GCAGCGGATGATGAAGGTGTTGG-3′)、E-cadherin(5′-TTTTCATCTTCCTCCTTCCTTCC-3′，5′ -AGACT TTCAAACAGACAGCACCA-3′)、vimentin(5′-TTGTC ACCCACTCTTCATTCATT-3′，5′-ATCAGTTCAGTTA GCCTGTTTCAG-3′)、α-SMA(5′-GTGTCAGCGTCCT TGATTTCCTC-3′，5′-GATGGGTCCATTCAGTTGGTT GT-3′)和GAPDH(5′-TGTGGGCATCAATGGATTT GG-3′，5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′)引物于荧光定量PCR仪进行RT-qPCR扩增，以U6和GAPDH为内参。扩增体系20 μL：2×定量PCR缓冲液10 μL，引物体系 (5 μmol/L)0.8 μL，ddH2O 5 μL，cDNA 4 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL。反应条件：95 ℃ 3 min(循环数1)；95 ℃ 12 s，62 ℃ 60 s(循环数40)；62 ℃～95 ℃，以0.2 ℃/2 s温度上升(循环数1)。RT-qPCR结果的判定：ΔCt =Ct目的基因-Ct内参，ΔΔCt=ΔCt糖肾组-ΔCt正常组，转染组相对表达量=2-ΔΔCt，对照组相对表达量=1。

1.3.2 Western blot和免疫组化检测Akt和EMT相关蛋白的表达：提取各组组织总蛋白，等量上样SDS- PAGE凝胶电泳，冰浴下80 V转膜90 min。37 ℃温箱封闭60 min，兔抗Akt、E-钙黏素、vimentin和鼠抗α-SMA、GAPDH(1∶500)一抗4 ℃过夜孵育，室温复温60 min，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1∶2 000)室温孵育60 min，凝胶成像分析仪曝光。免疫组化：石蜡切片70 ℃干烤过夜，顺序放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，无水乙醇Ⅰ和Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇及蒸馏水各15 min，脱蜡至水；0.01 mol/L柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)500 mL预加热至92 ℃，放入切片，维持温度92 ℃～98 ℃，抗原修复20 min，自然冷却至室温，ABC法免疫组化染色[3]。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 miR-451和EMT mRNA的表达

糖尿病组miR-451 mRNA的表达量为正常组的30.33%，显著降低(P<0.05)；E-钙黏素mRNA的表达量(0.48±0.88)也明显降低(P<0.05)；Akt、vimentin和α-SMA mRNA的表达量明显升高(P<0.05)，分别为(3.80±0.15)，(3.82±0.23)，(3.30±0.15)(图1)。

*P<0.05 compared with NKT group图1 Akt和EMT相关mRNA的表达量Fig 1 Akt and EMT related mRNA expression level

2.2 糖尿病组EMT相关蛋白的表达

与正常组相比，糖尿病组E-钙黏素蛋白表达量(0.37±0.03)显著降低(P<0.05) ；Akt、vimentin和α-SMA蛋白表达量明显增高(P<0.05)，分别为(0.61±0.04)，(0.66±0.03)，(0.69±0.05)(图2)。

2.3 EMT相关蛋白阳性评分

与正常组相比，糖尿病组E-钙黏素蛋白阳性评分(18.67±1.76)显著降低(P<0.05) ；vimentin、α-SMA蛋白阳性评分明显增高(P<0.05)，分别为(52.33±2.33)，(48.67±2.33)(图3)。

3 讨论

糖尿病肾病(DN)目前已成为终末期肾脏病的第2原因，仅次于各种肾小球肾炎[5]。DN临床分为5期，Ⅳ期即临床(显性)DN期，病情往往进行性发展，出现肾小管间质纤维化为主要特征的病理特点。

miRNAs是一类长度为19～25个核苷酸序列的非编码RNAs，参与了多种肾脏疾病，包括DN、狼疮性肾炎、IgA肾病、多囊肾及泌尿系肿瘤的发生发展过程[6]。miR-451对DN早期具有预防和保护作用，其作用机制尚不清楚。

EMT作为DN最主要的病理变化，影响肾脏纤维化的进展。miRNAs在DN发病机制中的作用远未阐明。miR-23b靶向HMGA2下调PI3K/Akt信号通路活性抑制DN EMT的发生[7]。14-3-3ζ蛋白能够磷酸化Akt的Thr408活化位点调控Akt活性，从而发挥其调控细胞增殖、迁移和代谢等功能[8]。DN是多因素综合作用的结果，因此，进一步研究抑制TEMT发生机制，对防治DN肾纤维化进展，保护肾功能具有重要意义。

本研究表明，与正常组相比，糖尿病组miR-451mRNA和E-钙黏素mRNA的表达量明显降低，Akt、vimentin和α-SMA mRNA的表达量明显升高； DNKT组E-钙黏素蛋白表达量显著降低，Akt、vimentin和α-SMA蛋白表达量明显增高；DNKT组E-钙黏素蛋白表达量显著降低，vimentin、α-SMA蛋白表达量明显增高，提示在DN中miR-451很可能通过靶向Akt负向调控EMT的进展。