宫腔灌注人绒毛膜促性腺激素改善多囊卵巢综合征患者子宫内膜容受性

孙家珍，潘瑞洋，申素芳*

(新乡医学院第三附属医院 1.生殖医学科； 2.心血管内科，河南 新乡 453003)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种多因性的内分泌综合征，是育龄期女性内分泌失调和排卵性不孕的常见原因之一，影响着女性生育、代谢及心理健康[1]。大量的证据表明复杂的内分泌及代谢变化使其子宫内膜容受性下降可能是PCOS患者低妊娠率、高流产率的原因之一[2]。本文以着床窗期的子宫内膜为研究对象，给予宫腔灌注人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin, hCG)，评价子宫内膜容受性的状态，为PCOS患者的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：研究组：选取新乡医学院第三附属医院生殖医学科2016年04月至2018年04月就诊的PCOS患者50例(失访5例)。纳入标准：1)符合2003年鹿特丹标准；2)25～35岁，月经周期25～ 35 d；3)无内科合并症，双侧输卵管通畅，且无生殖系统器质性病变；4)排除男方因素的影响；5)近3个月无宫腔内机械操作史。研究组随机分为研究组1(n=25)及研究组2(n=20)。

对照组：同一时期就诊于新乡医学院第三附属医院生殖医学科的因男方轻度少弱精症(mild oligozoospermia)就诊的患者25例(失访2例)，23～35岁。入组标准：基础内分泌正常，近3个月无使用激素类药物史及宫腔操作史；月经周期规律、双侧输卵管通畅、正常排卵；生殖系统无器质性病变。

全部研究对象均知情告知并签署同意书，本研究获得新乡医学院第三附属医院伦理委员会批准，批准文号：(2016)伦审[临]第(03)号。

1.1.2 试剂：ER和PR单克隆抗体及免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；4%多聚甲醛(上海谱振生物科技有限公司)；2.5%戊二醛(青岛捷世康生物科技有限公司)；二甲苯(天津东丽区天大化学试剂厂)；来曲唑片(江苏恒瑞药业有限公司)；hCG(丽珠集团丽珠制药厂)。

1.2 研究方法

1.2.1 分组：对照组(n=23)为自然周期；研究组1(n=25)、研究组2(n=20)均给予促排卵药物(月经第5～9天口服来曲唑2.5～5 mg qd)，研究组2口服来曲唑同时于排卵前2日及排卵日分别给予hCG 500 IU/mL宫腔灌注1次。

1.2.2 超声监测：从月经第10天开始，连续阴道超声行子宫内膜及卵泡监测至排卵(如不排卵则放弃本周期)，排卵后第6～8天为着床窗期。同时根据卵泡直径的大小决定宫腔灌注hCG时间。

1.2.3 hCG宫腔灌注：研究组2于排卵前2 d及排卵日分别给予hCG 500 IU/mL(1 000 U/支，用1 mL 0.9%氯化钠溶液溶解) 宫腔灌注1次。

1.2.4 内膜标本收集：各组均于排卵后第6～8天用一次性S型宫腔组织吸引管[浙食药监械(准)字2014第2660911号，产品规格：TY-C3.1/30-1S]抽取内膜组织，将抽取到的子宫内膜用0.9%氯化钠溶液彻底冲洗干净后，分两份：一份用4%的多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片和免疫组化染色；另一份投入2.5%戊二醛溶液中固定，用日立扫描电镜(S-3500N)观察子宫内膜胞饮突的发育情况。各组均于取内膜日抽血检测血清雌激素(estrogen,E2)和孕激素(progesterone,P)水平。

1.2.5 扫描电镜观察：用2.5%戊二醛溶液固定后依次经乙醇梯度脱水和叔丁醇干燥，用IB-3喷金离子镀膜仪喷金处理后在S-3500N日立电子扫描电镜下观察。

1.2.6 免疫组化染色：检测子宫内膜中雌激素受体(estrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor,PR)的表达。对固定后的子宫内膜标本进行脱蜡、水化，分别加入抗体，脱水、透明、封片后镜检。子宫内膜腺上皮及间质细胞核出现黄褐色颗粒者为阳性表达，每张切片任意取5 个视野，计数每个视野阳性细胞比率，取平均数为每张切片的阳性细胞率。

1.2.7 妊娠率计算：各组均于排卵后16 d抽取外周静脉血3 mL，测定血清hCG值，确定妊娠，计算妊娠率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况比较

3组研究对象的年龄、不孕年限、内膜厚度(排卵日)无差异(表1)。

表1 一般情况的比较Table 1 General condition

2.2 着床窗期血清E2、P的测定

研究组1、研究组2着床窗期E2水平与对照组无差异。与对照组相比，研究组1着床窗期P水平降低(P<0.05)；与研究组1相比，研究组2着床窗期P水平升高(P<0.05)(表2)。

表2 子宫内膜着床窗期血清E2、P水平的比较

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with the study group 1.

2.3 免疫组织化学染色

2.3.1 子宫内膜中PR表达：PR阳性表达为子宫内膜间质细胞核出现褐色颗粒。对照组、研究组1、研究组2子宫内膜上PR阳性表达率分别为38.36%±0.51%、18.63%±0.62%、40.17%±0.53%。与对照组比较，研究组1子宫内膜PR阳性表达率减少(P<0.05)，且研究组2子宫内膜PR阳性表达率高于研究组1(P<0.05)(图1)。

2.3.2 子宫内膜中ER表达：ER阳性表达为子宫内膜腺上皮及间质细胞核内出现褐色颗粒。对照组、研究组1、研究组2子宫内膜上ER阳性表达率分别为38.73%±0.56%、34.26%±0.71%、36.42%±0.63%(图2)。

2.4 扫描电镜结果

发育中的胞饮突，细胞表面形成光滑、菲薄的内膜突起；发育完全的胞饮突，微绒毛减少，子宫内膜表面突起，形如蘑菇；退化的胞饮突，突起减少，微绒毛再次出现，突起物表面褶皱增多，细胞体积增大。

与对照组相比，研究组1成熟期胞饮突的表达率降低(P<0.05)；与研究组1相比，研究组2成熟期胞饮突的表达率升高(P<0.05)(表3,图3)。

2.5 排卵后16 d各组妊娠情况比较

排卵后16 d研究组1、组2及对照组血清β-hCG阳性总例数分别为：9、7、9。研究组1总妊娠率(28.0%)明显低于对照组(39.1%)(P<0.05)；研究组2总妊娠率(45.0%)明显高于研究组1(P<0.05)。

3 讨论

PCOS患者多存在子宫内膜胞饮突发育不良，出现子宫内膜容受性下降，这可能是导致PCOS患者生育能力低下和高流产率的原因之一[3]。子宫内膜容受性又称“着床窗”，它是内膜的一种状态，是影响妊娠成功建立的重要因素。胚胎的成功着床取决于胚泡的侵入能力和子宫内膜处于最佳容受状态[4-5]，电镜下可见着床窗期的子宫内膜上有成熟胞饮突出现，这标志着子宫内膜容受性处于最佳状态[6]。

图1 各组子宫内膜间质细胞中PR的表达Fig 1 Expression of PR in endometrial stromal cells of each group(immunohistochemically staining, ×400)

图2 各组子宫内膜腺上皮及间质细胞中ER的表达

图3 扫描电镜下不同时期胞饮突的表现Fig 3 Performance of pinopode in different periods under scanning electron microscopy(×4 000)

表3 成熟期胞饮突的比较Table 3 Comparison of matured pinopode

*P<0.05 compared with the control group;#P<0.05 compared with the study group 1.

hCG是胚胎植入过程产生的最为密切的信号分子，在正常的妊娠过程中发挥广泛的作用，hCG可以通过延迟子宫内膜蜕膜化进程及延长子宫内膜着床窗等增加子宫内膜容受性[7]。宫腔内灌注hCG可以引起子宫内膜水平各种生长因子的显著改变，从而引发其下游效应而有助于妊娠的发生[8]。移植前宫腔灌注hCG可以提高胚胎植入率和妊娠率[9]。本研究发现宫腔灌注hCG可增加成熟期胞饮突数量，提示hCG对子宫内膜胞饮突的形成与成熟有促进作用，可改善PCOS患者的子宫内膜容受性。

研究发现，P水平及子宫内膜上PR的表达在一定程度上决定着子宫内膜的容受性[10]。排卵后P水平升高，着床窗期PR表达上调，使子宫内膜达到最佳容受状态[11]。PCOS患者着床窗期P不足，PR表达降低，使着床窗期延迟出现，胚胎与内膜发育不同步，导致着床率下降[12]。PCOS患者的子宫内膜中ER、PR表达下降和缺乏周期性变化可能是胚胎着床障碍的重要原因。本实验的结果显示PCOS患者着床窗期胞饮突的发育不良可能与P水平、PR表达降低相关；宫腔灌注hCG可提高P水平及PR表达，使成熟期胞饮突数量增多，使子宫内膜容受性升高，可提高妊娠率。

综上所述，PCOS患者着床窗期胞饮突发育不良，宫腔灌注hCG可能使成熟期胞饮突数量增加，改善子宫内膜容受性，提高妊娠率。着床窗期P水平降低及PR的低表达可能是PCOS患者子宫内膜胞饮突发育不良的原因之一，宫腔灌注hCG可升高P水平和增加PR的表达，可能与子宫内膜容受性的改善相关。

志谢：感谢河北医科大学电镜实验中心对本研究提供的帮助。