小美牛肝菌辅助治疗运动障碍效果

杨华莉，王晓燕，李克雷

（河北民族师范学院体育系，河北 承德 067000）

小美牛肝菌（Boletus speciosus） 是牛肝菌属（Boletus） 真菌，广泛分布于世界各地，是一种具有微毒性的菌类，过量摄入容易出现“幻视”中毒，使人产生幻觉[1]。其主要原因是含有一些异恶唑衍生物和生物碱物质，容易造成人中枢神经紊乱，使人产生幻觉[2]。但小美牛肝菌中也含有一些抗氧化物和生物碱类化合物，如γ-三甲胺基丁酸、硫组氨酸甲基铵盐等，这些有效成分能降低胆固醇和改善冠状动脉血流量，对心肌缺氧和增加运动耐力有一定功效。而且生物碱是一种中枢神经兴奋剂，可以减少抑制性神经递质的释放，调节氨基酸神经递质的释放。小剂量使用可以对一些抑郁、焦虑等神经系统运动障碍病症起到辅助治疗的效果[3]。

1 材料与试剂

BS-224电子天平，德国SARTORIUS公司；DZ-1BC真空干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司；FW400A万能粉碎机，北京科伟永鑫实验仪器厂；TC31-10B小鼠转轮式疲劳仪，北京精测电子科技有限公司；XR-XZ301开场实验视频分析系统，上海欣软信息科技有限公司。

茚三酮试剂、双缩脲试剂、Fehling试剂，沈阳先创化工有限公司；a-萘酚、浓硫酸、乙醇、盐酸、氢氧化铵，天津市天力化学试剂有限公司；硅钨酸、碘化铋钾、碘化汞钾，天津市富宇精细化工有限公司；6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine hydrobromide），上海莼试生物技术有限公司；以上试剂均为分析纯。

2 小美牛肝菌定性检测

采用系统预试法对小美牛肝菌进行若干定性试验，根据其成分理化性质不同，利用特征显色、沉淀反应对小美牛肝菌的水提取液样品进行定性检测。

2.1 样品及供试液制备

试验用小美牛肝菌购自云南木水花野生菌市场，取一定量的新鲜小美牛肝菌清净、晾干、切片，在60℃下烘箱中干燥60 min后，上粉碎机制成粉末状，过80目筛备用。水提取液的制备：称取小美牛肝菌粉末50 g于锥形瓶中，加去离子水500 mL混合均匀，浸渍24 h后用滤纸过滤，取滤液即得小美牛肝菌样品试液。

2.2 氨基酸和多肽及蛋白质定性试验

利用加热条件下氨基酸或多肽与茚三酮发生化学反应生成紫蓝色物质的原理进行定性试验[4]。取小美牛肝菌样品试液滴在滤纸上，再滴茚三酮试剂，烘箱烘干后观察滤纸，发现滤纸上出现深蓝紫色斑块；再取小美牛肝菌样品试液1 mL放入试管，加入双缩脲试剂摇匀，观察试管发现呈紫红色；茚三酮和双缩脲试验均表明小美牛肝菌样品中含有氨基酸、多肽类物质。取小美牛肝菌样品试液1 mL放入试管，加5%硫酸摇匀发现试管溶液变混浊，有少量沉淀物产生，表明小美牛肝菌样品中可能含有蛋白质物质。

2.3 还原糖和多糖及糖苷类定性试验

按参考文献[5]进行试验，通过Fehling反应来进行还原糖鉴定。取小美牛肝菌样品试液1 mL放入试管，加数滴Fehling试剂，并在100℃下水浴5 min，观察发现有棕红色沉淀物产生，证明小美牛肝菌样品含有还原糖；取小美牛肝菌样品试液1 mL放入试管，加数滴a-萘酚溶液摇匀，再沿试管壁缓慢滴入2滴浓硫酸，观察试管中浓硫酸的接触面，发现有紫红色环，Molish反应证明了小美牛肝菌样品中含有多糖或糖苷类物质。

3 小鼠运动障碍试验

帕金森病是一种神经疾病，常见于老年群体，主要表现是病人的行动身体不稳、肢体抖动等运动性障碍现象[6]。病因目前还不十分清楚，主要病理变化是大脑黑质部分多巴胺神经元失常或细胞受损甚至死亡。6-羟基多巴胺作为一种神经毒素，可以感染神经元细胞发生变性，产生过氧化现象使神经受损，多巴胺代谢物质的增多现象与帕金森症病理表现相似，因此被广泛用于运动障碍模型的研究中。本文中以6-羟基多巴胺建立小鼠运动障碍模型，对小美牛肝菌的辅助治疗效果进行试验研究。

3.1 试验动物及分组

试验选用昆明SPF级小鼠50只，体重20 g～25 g，由苏州爱尔麦特实验动物有限公司提供。试验动物生产许可证号为SCXK(苏） 2014-0007。对试验动物进行分笼饲养，每笼10只，饲养温度22℃～25℃，相对湿度50%～70%，自由进食进水，光照周期12 h/12 h。小鼠适用性喂养1周，在此期间每天对小鼠进行转轮适应性训练，转速设置为20 r·min-1～300 r·min-1，转动时间和间歇时间均为5 min，第1天训练5次，以后每天增加1次，期间观察小鼠转轮行为，剔除行为异常和不适应训练的小鼠。

适用性喂养训练完成后，将合格小鼠随机分5组，每组5只。运动障碍组：每日定时给小鼠腹腔注射6-羟基多巴胺（20 mg·kg-1）；高剂量组：每日1次定时经口灌胃小鼠小美牛肝菌样品溶液，剂量为60 mL；中剂量组：每日1次定时经口灌胃小鼠小美牛肝菌样品溶液和纯净水各30 mL；低剂量组：每日1次定时经口灌胃小鼠小美牛肝菌样品溶液10 mL和纯净水50 mL。对照组：每日1次定时经口灌胃小鼠纯净水60 mL；以上各组均连续注射、灌胃1周。

3.2 转轮试验

每天灌胃1 h后进行转轮试验，将转轮式疲劳仪转速设置为25 r·min-1，记录每只小鼠掉下转轮的时间，每只小鼠间歇时间为5 min，记录3次，将3次时间累加记为小鼠的转轮试验时间。连续灌胃并记录10 d，期间小鼠正常饲养，自由进食进水。

3.3 平衡木试验

自制长×宽为300 mm×15 mm的木棒，两端架起，离地高度以小鼠身体不能接触地面为准。每天小鼠灌胃1 h后进行平衡木试验，将小鼠放置于木棒中央，待小鼠抓固木棒后开始记时，小鼠坠落停止记时，测试3次，中间间歇5 min，取平均时间为测试时间。

3.4 旷场试验

旷场试验又称开场试验，应用开场实验视频分析系统的试验箱，每天小鼠灌胃1 h后，按分组将1组5只小鼠放入50 mm×500 mm的试验箱中，自由活动，开场试验系统会自动记录小鼠活动轨迹和活动距离，用于了解小鼠的活动兴奋度，研究小美牛肝菌样品对小鼠自主活动和运动神经系统的影响。

4 试验结果与分析

4.1 小美牛肝菌对小鼠转轮时间的影响

转轮试验结果如表1所示。

表1 小美牛肝菌对运动障碍小鼠转轮时间的影响Tab.1 Effect of Boletus speciosus on rotation time of dyskinesia mice

由表1可以看出，注射6-羟基多巴胺的运动障碍组与对照组（CK）相比，转轮时间大幅缩短（P＜0.01），从实际观察现象来看，部分障碍组小鼠很快就掉下转轮；灌胃小美牛肝菌样品溶液的3个组小鼠的转轮时间均有增加（P＜0.05），增加样品剂量可以延长转轮时间，一定程度上改善了小鼠的运动障碍，起到了延长小鼠运动时间的作用。

4.2 小美牛肝菌对小鼠平衡时间的影响

平衡木试验结果如表2所示。

表2 小美牛肝菌对运动障碍小鼠平衡时间的影响Tab.2 Effect of Boletus speciosus on balance time of dyskinesia mice

由表2可以看出，注射6-羟基多巴胺的运动障碍组与对照组（CK）相比，小鼠在平衡木上的时间大幅缩短（P＜0.01）；灌胃小美牛肝菌样品溶液的3个组小鼠的停留时间均高于运动障碍组（P＜0.05），而且停留时间与样品剂量成一定的正比关系。该试验结果说明小美牛肝菌能够改善小鼠的前庭运动功能，对帕金森病引起的运动性障碍有一定的功效。

4.3 小美牛肝菌对小鼠旷场试验的影响

旷场实验结果如图1所示。

由图1可以看出，对照组、运动障碍组与低剂量组、中剂量组、高剂量组的小鼠平均移动速度分别为：（42.7±8.2） mm·s-1、（16.5±5.3） mm·s-1、（22.3±6.4） mm·s-1、（26.4±9.1） mm·s-1、（25.7±4.3）mm·s-1。注射6-羟基多巴胺后的小鼠与对照组（CK） 相比平均移动速度明显降低（P＜0.01）；而灌胃小美牛肝菌样品溶液的3个组均比运动障碍组有所提高（P＜0.05）。但随着灌胃剂量的加大速度增加不明显。另外通过各组小鼠的自由活动轨迹也可以看出，与对照组比较，运动障碍组的活动轨迹明显稀疏，而高、中、低3个剂量组的活动轨迹与运动障碍组相比要稠密的多。旷场试验结果说明小美牛肝菌能够改善小鼠的自主神经兴奋度，减轻运动障碍程度，缩短运动障碍症状的持续时间。

5 结论

小美牛肝菌内含的氨基酸、多肽、蛋白质、糖类物质，改善了小鼠的运动障碍症状，对帕金森病引起的运动性障碍有一定的功效。其作用机理可能是对小鼠神经系统损伤的抑制，但小美牛肝菌也含有生物碱类毒物，对运动障碍的治疗效果和副作用还有待临床验证。