低海拔地区黑苦荞酚类物质含量、组成及抗氧化活性研究

孙坤坤　侯泽豪　魏淑东　方正武

摘要：  為探究黑苦荞的市场利用价值，该研究选择种植于湖北江汉平原低海拔地区的川荞1号和九江苦荞作为材料，分析苦荞籽粒中游离酚、结合酚、总酚、游离黄酮、结合黄酮和总黄酮的含量，利用DPPH自由基法、ABTS自由基法和铁离子还原抗氧化法（FRAP）三种抗氧化测试模型综合评价其体外抗氧化活性，并运用高效液相色谱（HPLC）技术对其酚类物质的组成进行鉴定。结果表明：（1）川荞1号籽粒的总酚和总黄酮含量显著高于九江苦荞，分别为27.38 mg GAE·g-1 DW、31.46 mg RE·g-1 DW和12.71 mg GAE·g-1 DW、14.68 mg RE·g-1 DW;其中游离酚与游离黄酮含量显著高于结合酚与结合黄酮含量，均占总酚和总黄酮含量的79%以上，且九江苦荞中结合酚和结合黄酮的含量高于川荞1号。（2）苦荞籽粒中酚类物质主要由芦丁、槲皮素、表儿茶素、山奈酚、山奈酚-3-芸香糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷-3′-O-吡喃葡萄糖苷等黄酮类化合物组成，其中游离酚以芦丁和槲皮素为主，结合酚以表儿茶素和芦丁为主。（3）苦荞籽粒提取物均具有一定的抗氧化活性，黑苦荞川荞1号游离态DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力值分别为30.14、11.03、18.84 mg TE·g-1 DW，高于九江苦荞，而结合态三种抗氧化能力值低于九江苦荞，但黑苦荞川荞1号总抗氧化能力显著高于九江苦荞。在低海拔地区江汉平原，种植的黑苦荞川荞1号籽粒具有较高含量的酚类物质，符合后续的食品加工的生产要求，市场开发前景广阔。

关键词： 黑苦荞， 游离酚， 结合酚， 高效液相色谱， 抗氧化活性

中图分类号：  Q945文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2020）02-0210-08

Abstract：  In order to explore the market value of black tartary buckwheat，  we analyzed the phenolics and antioxidant activities of Chuanqiao 1 and Jiujiang Kuqiao， two tartary buckwheat varieties planted in the low-elevation regions of the Jianghan Plain of Hubei， determined the contents of free， bound and total phenolics and flavonoids， and we analyzed the antioxidant activities of their seed extracts  in vitro using the DPPH free radical， ABTS free radical and iron ion reduction antioxidant （FRAP） assays， and we also determined the phenolic compositions of the seed extracts by the high performance liquid chromatography （HPLC）. The results were as follows： （1） The contents of total phenolics and total flavonoids were significantly higher in the seeds of Chuanqiao 1 than those of Jiujiang Kuqiao， with the former standing at 27.38 mg GAE·g-1 DW and 31.46 mg RE·g-1 DW and the latter at 12.71 mg GAE·g-1 DW and 14.68 mg RE·g-1 DW ; in the seeds of the two varieties， the contents of the free phenolics and flavonoids， which made up more than 79% of the total phenolics and flavonoids， were significantly higher than those of bound phenolics and flavonoids; the contents of bound phenolics and flavonoids were higher in the seeds of Jiujiang Kuqiao than those of Chuanqiao 1. （2） Rutin， quercetin， epicatechin， kaempferol， kaempferol-3-rutinoside and quercetin-3-O-rutinoside-3′-O-glucopyranoside dominated among the phenolic compounds in the seeds of the black tartary buckwheat varieties， with rutin and quercetin dominant phenolics among the free phenolic compounds and epicatechin and rutin dominant among the bound ones. （3） All the seed extracts of the tartary buckwheat varieties presented antioxidant activities and the antioxidant activities of the free seed extracts of Chuanqiao 1， determining as being 30.14， 11.03 and 18.84 mg TE·g-1 DW using DPPH， ABTS and FRAP， respectively， were higher than those of Jiujiang Kuqiao. The antioxidant activities of the bound extracts of Chuanqiao 1 were lower than those of Jiujiang Kuqiao， but the total antioxidant acti-vity of the former variety was significantly higher than that of the latter one. Therefore， planted in low-elevation regions of the Jianghan Plain， Chuanqiao 1 had higher contents of seed phenolic compounds， as being required in subsequent food processing and presenting a bright market prospect.

Key words： black tartary buckwheat， free phenolics， bound phenolics， high performance liquid chromatography （HPLC）， antioxidant activity

荞麦分甜荞（Fagopyrum esculentum）和苦荞（F. tataricum）两个栽培种，集中分布在我国华北、西北和西南等地区（侯建霞，2007）。随着人们生活水平的不断提高和健康饮食观念的增强，以苦荞为原料的加工产品越来越受到消费者的青睐，这主要是与其富含多种营养物质，如蛋白质、维生素和多酚等有关（Zhu，2016）。植物多酚是植物代谢过程中产生的一类次生物质，主要以游离态和结合态的形式存在于植物细胞中（邵雅芳，2014;颜才植等，2015）。游离酚是可被有机溶剂提取的酚类物质，而结合酚是以共价键的形式与植物体相结合，不能被有机溶剂直接提取（Pe′rez-Jime′nez & Torres，2011）。尽管已有研究报道苦荞中总酚、总黄酮的含量及其抗氧化活性（李海萍，2010;刘琴等，2014;周晓婷，2017），但是这些报道多集中于分析可被有机溶剂提取的游离酚部分，而对于结合态酚类物质的结构特征及其生物活性还很少涉及。Adom & Liu（2002）研究发现，玉米、小麦、大米等谷物中的酚类物质主要是以结合酚的形式存在。Liu（2007）认为，相对于游离酚，结合酚经过肠道微生物发酵作用后可能具有更高的生物活性。因此，系统分析苦荞多酚的存在形式、结构组成对加强苦荞功能开发具有重要意义。

Klepacka et al.（2011）和邓浩（2014）发现，多酚类物质的含量和抗氧化活性与其品种和种植环境密切相关。国旭丹等（2019）研究表明，地区环境如海拔、降水量和日照时间等会显著影响苦荞多酚的含量。Guo et al.（2011）也发现生长环境以及品种与环境之间相互作用可能对苦荞多酚物质的积累和抗氧化活性产生影响。但是随着当前农业结构调整，发展绿色食品和农民增收的需要，低海拔平原地区的小宗粮豆作物的生产重新引起了重视。基于此，本研究在低海拔地区种植川荞1号黑苦荞和九江苦荞两个品种，分析其籽粒中游离酚和结合酚的含量、组成及其抗氧化活性进行分析，旨在揭示低海拔地区黑苦荞中酚类物质存在的形式和结构特征，以期为低海拔平原地区生产的黑苦荞深加工和品种优化提供理论依据。

1材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料试验于2018年8月15日在湖北省江汉平原长江大学农业科研基地（112°15′ E、30°36′ N，海拔34 m）进行，该试验基地土壤以重壤和粘土为主，养分高，土地平整，水源排灌方便，前茬为大豆。土壤pH为7.60左右，有机质2.93%，全氮0.16%，有效磷和有效钾分别为16.63和104.74 mg·kg-1。供试品种为川荞1号和九江苦荞，条播，正常田间管理，11月份收获，种子晒干后，经人工去壳、冷冻干燥、加工，贮存于-20 ℃冰箱备用。

1.1.2 试剂与仪器试剂：山奈酚-3-芸香糖苷（Kaempferol-3-rutinoside）购自于ApexBio公司;山奈酚（kaempferol）、表儿茶素（epicatechin）、槲皮素（quercetin）、没食子酸（gallic acid，GA）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1， l-Diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH·）、2′-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）铵盐 [2， 2′-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、三吡啶基三嗪（TPTZ）、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）等购自于Sigma 公司;色谱纯乙腈、乙酸和标准品芦丁（rutin）购自于麦克林公司;其他试剂均为市售分析纯。

仪器：Allegra X-30R系列离心机（美国贝克曼库尔特公司），N-1200B旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），真空冷冻干燥机（德国Martin Christ公司），双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 游离酚的提取参考Perales-Sánchez et al.（2014）的方法并略有修改。1 g荞麦粉加入8 mL正己烷，充分震荡，4 ℃、4 000 ×g下离心10 min后去除上清液，重复3次。再向沉淀中加入8 mL 80%乙醇，室温下浸提30 min，每隔10 min震荡一次，4 ℃、4 000 ×g下离心10 min后取上清液，同样步骤重复3次，合并浸提液，37 ℃下旋转蒸发近干，用80%乙醇定容至5 mL，-20 ℃保存备用。

1.2.2 结合酚的提取参照Sun et al.（2002）的研究方法，首先向上述游离酚提取残渣中加入20 mL 2 mol·L-1 NaOH，在氮气条件下室温震荡水解1～2 h后，其次用6 mol·L-1 HCl将pH调至1.5～2.0之间，最后在溶液中加入10 mL乙酸乙酯进行萃取，4 ℃、4 000 ×g下离心10 min收集乙酸乙酯部分，重复5次，合并有机溶剂，37 ℃下旋转蒸发干，用50%甲醇复溶并定容至5 mL，-20 ℃保存备用。

1.2.3 总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法测定川荞1号和九江苦荞籽粒中总酚的含量（Julkunen-Tiitto，1985）。以没食子酸为标准当量表示总酚的含量（mg Gallic acid eq·g-1干重样品），简写为mg GAE·g-1 DW。

1.2.4 黄酮含量测定采用NaNO2-AlCl3·6H2O方法测定川荞1号和九江苦荞籽粒中总黄酮的含量（Jia et al.，1999）。以芦丁为标准当量表示总黄酮的含量（mg Rutin eq·g-1干重样品），简写为mg RE·g-1 DW。

1.2.5 HPLC法测定酚类物质组成及含量苦荞提取物酚类物质的组成参照Jiang et al.（2015）建立的方法，结果以mg·g-1表示。对于槲皮素-3-O-芸香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷，其含量以芦丁为标准表示。

1.2.6 抗氧化性测定

1.2.6.1 DPPHDPPH自由基清除能力的测定参考Brand-Williams et al.（1995）研究方法。DPPH值以每1 g干重样品中奎诺二甲基丙烯酸酯当量（Trolox）表示，单位为mg Trolox eq·g-1干重样品，简写为mg TE·g-1 DW。

1.2.6.2 ABTSABTS自由基清除能力的测定参照Re et al.（1999）的研究方法。ABTS以每1 g干重样品中奎诺二甲基丙烯酸酯当量（Trolox）表示，单位为mg Trolox eq·g-1 干重样品，简写为mg TE·g-1 DW。

1.2.6.3 FRAPFRAP还原抗氧化能力的测定参照Benzie & Strain（1996）研究方法。FRAP值以每1 g干重样品中奎诺二甲基丙烯酸酯当量（Trolox）表示，单位为mg Trolox eq·g-1 干重样品，简写为mg TE·g-1 DW。

1.3 数据处理与分析

利用Excel 2013和SPSS 19.0 软件进行数据统计和分析，每个处理重复3次，数据以平均值±标准差（x±s）表示，使用线性回归分析进行多酚和黄酮与抗氧化能力之间的相关分析。

2结果与分析

2.1 苦荞产量和产量性状

由表1可见，川荞1号和九江苦荞单株粒数约为117，无显著差异;但九江苦荞的千粒重（19.13 g）显著高于川荞1号（18.24 g），且其产量显著高于川荞1号，超出5%。

2.2 多酚和黄酮含量

由图1：A可见，川荞1号籽粒中游离酚含量（25.29 mg GAE·g-1 DW）显著高于九江苦荞（10.10 mg GAE·g-1 DW），占总酚含量的90%以上，但川荞1号中结合酚的含量（2.08 mg GAE·g-1 DW）低于九江苦荞（2.61 mg GAE·g-1 DW）;由图1：B可知，川荞1号提取物中游离黄酮含量为30.66 mg RE·g-1 DW，约占总黄酮含量的97%，且显著高于九江苦荞游离黄酮的含量（13.36 mg RE·g-1 DW），而结合黄酮的含量仅为0.81 mg RE·g-1 DW，低于九江苦荞结合黄酮的含量（1.32 mg RE·g-1 DW），并且川荞1号和九江苦荞总酚和总黄酮含量存在显著差异。表明苦荞提取物中酚类物质主要以游离态的形式存在，且黑苦荞川荞1号具有更高的酚类物质含量。

2.3 酚类物质组成及含量

如图2所示，在川荞1号和九江苦荞游离态和结合态提取物中共鉴别到6种黄酮物质，依次是槲皮素-3-O-芸香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷、表儿茶素、芦丁、山奈酚-3-芸香糖苷、槲皮素和山奈酚（峰1-峰6）。6种黄酮单体含量如表2所示，川荞1号游离态提取物中6种单体含量均高于九江苦荞。其中川荞1号和九江苦荞游离态提取物中芦丁的含量（分别为16.78和6.47 mg·g-1 ）显著高于其他物质，分别占游离态黄酮含量的54.74%和48.41%;其次为槲皮素（分别为3.04和0.61 mg·g-1），分别占游离黄酮含量的9.92%和4.60%。结合态提取物中以表儿茶素和芦丁为主，其中川荞1号和九江苦荞中芦丁的含量（0.28 和0.48 mg·g-1）分别占结合黄酮含量的34.29%和36.62%，其次是山奈酚-3-芸香糖苷和槲皮素。川荞1号结合酚中山奈酚的含量最低，但是在九江苦荞结合酚中并未检测到山奈酚。

2.4 抗氧化性分析

如表3所示，川荞1号游离态提取物的DPPH、ABTS和FRAP三种抗氧化能力值分别为30.14、11.03、18.84 mg TE·g-1 DW，其抗氧化能力均占总抗氧化活性的86.00%以上，高于九江苦荞的三种抗氧化能力值。结合态提取物虽具有一定的抗氧化活性，但其在总抗氧化活性的占比较小，且川荞1号结合态提取物抗氧化能力低于九江苦荞。

2.5 相关性分析

川荞1号提取物中酚类、黄酮和抗氧化能力（DPPH、ABTS、FRAP）之间的相关性分析结果见表4。多酚和黄酮与DPPH、ABTS和FRAP均顯著相关，R值大于0.9（P<0.01）。并且三种抗氧化能力之间显著相关，R值在0.867～0.965之间。

3讨论

3.1 低海拔地区黑苦荞籽粒的多酚组成和分布

多酚类物质作为一类重要的抗氧化成分，普遍分布在蔬菜、水果和谷物中。本研究表明，低海拔地区种植的川荞1号黑苦荞籽粒中总酚（27.38 mg GAE·g-1 DW）和总黄酮（31.46 mg RE·g-1 DW）的含量显著高于九江苦荞（12.71 mg GAE·g-1 DW和14.68 mg RE·g-1 DW），推测可能与苦荞籽粒的形状和大小等有关（刘琴等，2014），并且本试验提取物中总黄酮含量显著高于陕西苦荞（7.23 mg RE·g-1 DW）（Liu et al.， 2018）。游离酚和游离黄酮占总酚和总黄酮含量的79%以上，说明苦荞籽粒中酚类物质主要以游离态的形式存在，这与Adom & Liu（2002）报道的玉米、小麦、大米等其他谷物酚类物质主要以结合态形式存在的结果相反，而与Guo et al.（2012）报道的苦荞酚类物质存在形式的结果基本一致。另外，川荞1号提取物中结合酚的含量（2.08 mg GAE·g-1 DW）低于九江苦荞 （2.61 mg GAE·g-1 DW）。相比于前人研究的四川凉山苦荞（0.096～0.308 mg GAE·g-1 DW）（李海萍，2010）、大豆（0.14～0.78 mg GAE·g-1 DW）（Wang et al.， 2016）和大米（0.38～1.08 mg GAE·g-1  DW）（Pang et al.，2018）中结合酚的含量，川荞1号和九江苦荞具有更高的应用价值，推测可能是多酚合成相关基因、地区生长环境、所选品种和提取溶剂等因素的差异导致（Xu & Chang， 2007; Guo et al.， 2011;张敏等，2018），这需要进一步深入研究。

通过HPLC初步确定苦荞籽粒中的酚类物质主要由黄酮类化合物构成，其中川荞1号中芦丁的含量高达17.06 mg·g-1，占总黄酮含量的50%以上，显著高于九江苦荞（6.47 mg·g-1）和四川苦荞（7.62～13.37 mg·g-1）（Peng et al.， 2017）。Li et al.（2010）和周晓婷（2017）报道苦荞中游离酚主要是芦丁和槲皮素，与本研究结果基本一致。而Guo et al.（2011）报道的关于苦荞结合酚主要是芦丁和儿茶素，与本研究结合态酚类物质主要是芦丁和表儿茶素的结果不一致，这可能是荞麦生长环境和所选择的荞麦品种等差异导致，这需要进一步深入研究。

3.2 黑苦荞籽粒的抗氧化活性

前人研究结果表明苦荞籽粒的抗氧化能力与多酚和黄酮含量成正相关 （刘琴等， 2014）。本研究发现川荞1号黑苦荞籽粒提取物的总抗氧化性显著高于九江苦荞的抗氧化性，其中DPPH和ABTS值高于Zhou et al.（2015）报道的陕西苦荞的抗氧化性，主要是因为川荞1号具有更高的多酚和黄酮含量，且多酚和黄酮含量与抗氧化性之间的相关系数均在0.92以上。提取物中游离态物质在DPPH、ABTS和FRAP的抗氧化能力占总抗氧化能力的72%以上，而结合态物质的抗氧化能力较低，说明苦荞籽粒提取物的抗氧化活性主要来源于游离态活性物质。因此，低海拔地区的黑苦荞籽粒富含多酚类化合物和较强的抗氧化活性，是优质苦荞生产和加工的优质原料基地。

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（责任编辑 何永艳）