鸡胚酶解多肽制备及其在HDF-α 细胞培养中的初步应用

耿 威，李 杨，战铁楠，耿晓宇，王莉红，迟春萍

1.长春园生肽生物科技有限公司，吉林长春 130062；2.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，生命科学学院，吉林长春 130012；3.吉林省正合生物技术有限责任公司，吉林长春 130052；4.长春生物制品研究所有限公司，吉林长春 130062

蛋白水解物质可以为细胞生长提供氮源、多种营养成分、生长增殖及贴壁黏附因子类似物等。有研究认为蛋白水解物可以为动物细胞生长提供氨基酸，并且其中某些特殊活性肽段对于细胞增殖、产物表达等功能具有促进作用，短肽可直接进入细胞膜后水解为游离氨基酸，从而为细胞代谢提供氮源，分子量较大的肽类可以作为生长因子或保护剂。

目前，国外已有针对多种细胞系的专用水解物，主要为大豆肽、水解乳蛋白等，但未见到鸡胚多肽在细胞培养上的应用。

鸡胚即鸡的胚胎，是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳完整的生命体。研究表明，鸡胚中包含的营养成分包括蛋白质、多肽、氨基酸、碳水化合物 (葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等 )、脂类、脂肪酸等。另外，鸡胚中还包括多种生物活性物质，小分子活性肽、细胞因子，生长因子，细胞黏附成分等小分子蛋白质。阮光萍等已证实鸡卵清提取液的不同组分对细胞增殖具有促进作用，但并未研究其水解物的特性。对于鸡胚的酶解多肽在细胞培养中的应用还未见报道。

本研究对鸡胚进行酶消化裂解后经超滤纯化获得相应分子量的蛋白肽，并将该多肽添加至细胞培养液中培养细胞，以HDF-α 细胞为模型，对该活性多肽在细胞培养中的作用展开了研究，为鸡胚酶解蛋白在HDF-α 细胞培养等中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

胰酶（trypsin，TR，美国，Sigma 公司）；MTT（美国，Sigma 公司）；DSMO（美国，Sigma 公司）；DPPH（美国，Sigma 公司）；细胞内ROS 检测试剂盒（美国，Sigma 公司）；其余试剂均为国产试剂。

1.2 主要仪器

JJ-2 型组织捣碎匀浆机；VCX130 型超声破碎仪；AHP-0013 型截留分子量为50KD 的中空纤维柱；K1160 全自动凯氏定氮仪；RPLC-MS/MS 系统由Finnigan Surveyor 液相色谱泵、线性离子阱（LTQ）质谱组成；Magic C18 AQ 反相色谱填料（5 µm，12 nm）；石英毛细管（75 μm×120 mm）；PHS-25 型酸度计；多功能酶标仪（TECANGENios）。

1.3 鸡胚酶解多肽原液制备

1.3.1 鸡胚准备及活性成分的初步提取

SPF 级受精鸡蛋置37.0±0.5 ℃孵化箱孵化，每2 h 自动翻蛋一次，半月后置-20 ℃停止孵化。对孵化的鸡蛋进行表面消毒，除蛋壳后取出鸡胚在4 ℃下以2 500 r/min 组织匀浆机匀浆，倒入灭菌后的密封盒中，放到-30 ℃的冷库中冷冻72 h，融化后于4 ℃的环境中对其进行细胞超声破碎，加入等量的注射用水，获得粗纯液，放置于4 ℃的冷藏库中备用。

1.3.2 精制提取

取1.3.1 制备的粗纯液，调pH 至7.5，加入胰酶至浓度为2.5%（质量分数）50 ℃热水浴， 水解1 h，在4 ℃下4 500 r/min 离心20 min，上清液超滤过50 kDa的滤膜，收集50 kDa以内的超滤液，调pH 值至6.8，除菌过滤为多肽原液。

1.3.3 原液理化性质分析

对1.3.2 获得的活性多肽原液经凯氏定氮法测定原液蛋白肽含量，计算分析制备工艺的收获率及回收率，经shotgun 分析蛋白及肽段组成及各肽段理化性质，并对多肽原液进行pH、渗透压及微生物限度检查、细菌内毒素检测鉴定。

1.4 鸡胚酶解多肽在细胞培养中的作用研究

将制检后的原液应用于人真皮成纤维细胞HDF-α（第六代）培养，观察其增殖情况，并用理化方法处理共同孵育的细胞，观察其耐受情况。每项试验均进行三次重复性实验。用SAS9.4 进行统计学分析比较，Bonferroni 校正（t1、P1 为与对照比较；t2、P2 为与上一个剂量组比较）。

1.4.1 促进细胞增殖功能研究

以MTT 法测定活性多肽对细胞增殖的促进作用，将人真皮成纤维细胞HDF-α（第六代）以1×104个/ 孔接种于96 孔板中，培养24 h 后，向96 孔板中分别加入含有不同浓度的多肽培养液（0，20，50，100，250， 500 µg/mL）继续培养48 h。在培养结束前4 h 每孔加入20 µLMTT（5 mg/mL），培养结束后，产生的紫色结晶用DMSO 溶解，在550 nm 波长条件下测定光吸收值。

1.4.2 在紫外损伤模型中鸡胚酶解多肽对细胞保护及修复的作用的研究

将HDF-α 细胞（第六代）以1×104个/孔接种于96 孔板中，24 h 后，用含有不同浓度的多肽培养液（0，20，50，100，250， 500 µg/mL）处理细胞，30 min 后，2 000 焦耳的紫外照射细胞，继续培养48 h。在培养结束前4 h 每孔加入20 µL MTT（5 mg/mL）。产生的紫色结晶用DMSO 溶解，在550 nm 波长条件下测定光吸收值。

1.4.3 抗氧化功能研究

通过ROS 检测试剂盒检测细胞内的ROS 含量来研究鸡胚酶解多肽在细胞中的抗氧化的功能：将HDF-α 细胞接种于6 孔板内，培养24 h 后，装载探针DCFH-DA（10 µm），37 ℃细胞培养箱内孵育30 min。分别加入含有不同浓度多肽的培养液 （100 µg/mL，200 µg/mL，400 µg/mL），37 ℃孵育 30 min 后，加入200 µm 的H2O2再孵育1 h。收集细胞，用PBS 重悬细胞，利用多功能酶标仪（TECAN，GENios）测定这些细胞的荧光值：激发光和发射光波长分别为：488 nm、525 nm。

2 结果与分析

2.1 鸡胚酶解多肽原液理化性质分析

经凯氏定氮法测定，原液蛋白肽的含量为16 mg/mL；经计算收率为91.1%；回收率为93.2%；经shotgun 分析，多肽达300 种之多，分别来自70 种不同的蛋白；经测定，最终的多肽原液pH 为6.82±0.05，渗透压为286 mmol/L，微生物限度检查及细菌内毒素检查合格。以上结果表明，本文所介绍的制备工艺制备的鸡胚酶解多肽原液各项理化性质符合细胞培养的条件，可将原液添加至细胞培养液中进行多肽对细胞培养影响的研究。

2.2 鸡胚酶解多肽对HDF-α 细胞增殖的影响

当多肽含量在250 µg/mL 和 500 µg/mL 时可以显著促进HDF-α 细胞生长，其增殖的程度分别为20%和40%，经统计学分析显示：加入50 µg/mL、100 µg/mL 浓度时与对照相比增殖结果有差异，组间差异不显著，加入250 µg/mL、500 µg/mL 其对照、组间相比差异显著，表明高浓度的原液能更有效的促进细胞的增殖。

2.3 鸡胚酶解多肽在细胞紫外损伤保护及修复模型中的作用

鸡胚酶解多肽可较好地保护HDF-α 细胞避免紫外损伤，并可促进细胞的紫外损伤修复，多肽含量在0 ～250 µg/mL 范围内其保护效果与多肽含量具有量效关系，当含量为250 µg/mL 时其保护效果接近100%，经统计学分析显示：当加入50 µg/mL以上浓度与对照比差异就不显著了，说明该浓度原液的加入细胞即可抵抗紫外的损伤；最高浓度与前一个剂量组相比具有差异性，说明该剂量保护效果比前一个剂量组具有更好的细胞保护作用。

2.4 鸡胚酶解多肽抗细胞内氧自由基功能

细胞内抗自由基试验显示：100 µg/mL 活性多肽溶液能够高效消除H2O2产生的自由基，其消除效率高达77%。经统计学分析显示：与对照组差异非常显著，表明加入100 µg/mL 多肽原液即可有效的抵抗H2O2对细胞产生的影响；随原液加入浓度的增加各组也有显著性差异，可能的原因是加入的多肽原液因细胞增殖较多引起的荧光值的升高。

3 讨 论

细胞的生长主要与培养基中的氨基酸含量、生长因子等有关，蛋白酶解多肽的添加主要为细胞生长提供了氮源、碳源及生长和黏附因子等，这种天然多肽产物的添加照普通培养基提供的培养条件更有利细胞的贴壁生长、细胞间的黏附及细胞增殖，并且蛋白的酶解产物含有的多肽及蛋白分子量较小，也去除了免疫蛋白及补体蛋白，照普通培养添加的血清更为安全，现普遍研究的为大豆蛋白酶解产物，乳清蛋白酶解产物，也被制成商品化的制品添加至特定的培养基中供特定的细胞培养使用，通过文献检索发现卵清蛋白酶解产物在细胞培养中的应用也有学者进行过研究，但对于鸡胚酶解多肽在细胞培养中的应用却未曾见到。

鸡胚即鸡的胚胎，是受精鸡蛋孵化至一定天数后，还未破壳完整的生命体。鸡胚照普通的鸡蛋相比，含有更多的促进细胞增殖分化表达的蛋白质及蛋白肽，也含有更多的细胞生长因子及细胞黏附因子，其酶解产物也更加适合添加入细胞培养液中，起到促进细胞增殖分化及保护细胞的作用。

HDF-α 细胞即人皮肤成纤维细胞，是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞，它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力，对培养环境的影响较为敏感，广泛应用于对细胞增殖、修复的影响的研究中，HDF-α 细胞更适合作为模型来研究鸡胚酶解多肽对细胞增殖及细胞损伤修复的影响。

本文制备出了分子量小于50kDa 的鸡胚酶解多肽原液，经鉴定各项指标符合细胞培养要求，将该原液添加至HDF-α 细胞培养液中，证明该酶解多肽可有效的促进HDF-α 细胞增殖，并且在细胞紫外线损伤保护修复模型中，该活性肽溶液表现出较好的保护效果。紫外线损伤主要表现在使细胞染色体DNA 及RNA 等遗传物质受到损伤，引起细胞死亡，也可因紫外线作用产生O3，形成更多氧自由基，引起细胞蛋白及遗传物质的变性，从而杀死细胞，而鸡胚酶解多肽中含有一些蛋白肽及还原性的氨基酸可帮助细胞进行遗传物质的修复，并可抵抗氧自由基的损伤，为验证，本文设立了抗氧自由基的试验，结果证明酶解多肽能够高效消除H2O2产生的氧自由基，其消除效率可高达77%，有效的保护了HDF-α 细胞免受氧自由基的损伤。

本文以HDF-α 细胞作为模型，研究了鸡胚酶解多肽对细胞增殖的促进作用，及保护细胞抵抗紫外及氧自由基的损伤的作用，为鸡胚酶解多肽应用于细胞培养提供了理论依据。

参考文献：略