长顺绿壳蛋鸡粪便益生菌的分离与鉴定

潘 永，杨 阳，杨 琦,3*

1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物疫病研究所，贵州贵阳 550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳 550025

长顺绿壳蛋鸡作为贵州省优势蛋鸡品种，具有耐粗饲、抗病力强、觅食能力强等特点，为了解该品种鸡肠道优势益生菌群的特点以及筛选防治禽类疾病的候选菌种，本研究将针对其粪便，通过严格厌氧培养、形态学观察、分子生物学鉴定几个方面对其优势型益生菌进行初步的分离和鉴定[1]。

1 材料与方法

1.1 样品来源

贵州省长顺县光辉绿壳蛋鸡产业集团采集的健康成年蛋鸡粪便20 份，置于无菌封口袋中，-20 ℃保存。

1.2 试剂及耗材

MRS 培养基、PBS、厌氧培养包（1 000 mL）、革兰氏染液。

1.3 分离纯化培养

称取粪便1 g 放入无菌10 mLPBS 缓冲液中搅拌均匀，用无菌纱布过滤杂质。以滤液为原液，每次稀释10 倍，分别用PBS 缓冲液稀释3 次，保留包含原液的4 个稀释梯度的样品。分别取各样品100 μL 用无菌三角玻璃棒涂布于MRS 培养基，放入厌氧培养包，密封后于37 ℃培养箱过夜培养。

1.4 细菌形态学观察

宏观：选取20 份粪便样品稀释培养后MRS 培养基，记录菌落数在30 ～100 的平板，挑选并标记优势菌，优势菌应同时具备以下特点：菌落总数最多，菌落形态较大。观察优势菌透明度、形状、边缘、颜色、湿润与否、光滑或粗糙。微观：酒精灯旁，钓菌环蘸取一滴无菌蒸馏水于无菌玻片中央，钓菌环挑取少量单个优势菌落与蒸馏水混合并以同心圆的形式扩散涂布，玻片于酒精灯火焰上方来回烘干，吸取一滴结晶紫染料于玻片中央并晃动使之覆盖附着于玻片的细菌，30 ～60 s 后用无菌蒸馏水轻轻冲洗，吸取一滴碘液于同样的位置并使其铺开，30 ～60 s 后无菌蒸馏水轻轻冲洗，吸取一滴95%乙醇脱色液于同样位置并铺开，20 ～30 s 后无菌蒸馏水轻轻冲洗，吸取一滴沙皇复染色液于同样位置并铺开，30 ～60 s 后蒸馏水轻轻冲洗，吸水纸从边缘将玻片上多余的水吸干，酒精灯火焰上方将玻片烘干，吸取一滴松节油到玻片中央，于光学显微镜1 000 倍观察细菌形态。

1.5 分子生物学鉴定

通过登陆NCBI 网站，下载并分析现有益生菌16S rDNA 基因序列，以同源性最高的上游序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTNAG -3’为正向通用引物，同源性最高的下游序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’为反向通用引物，通过Touchdown PCR 技术扩增20 份粪便样品优势益生菌16S rDNA 基因序列。扩增产物取10 µL 经1.2%琼脂糖凝胶检测后，胶回收送往上海勤邦生物有限公司测序。将测序结果导入NCBI 数据库进行BLAST 检测，比对分析其在细菌中的分类地位。

2 结果

2.1 细菌形态学观察结果

对20 份样品中优势益生菌的判断发现，A1 菌株在8 份粪便样品中被判定为优势菌，A2 在另外的6 份粪便样品中被判定为优势菌，A3 则在剩下的6 份粪便样品中被判定为优势菌。通过3 株优势益生菌进行宏观和微观形态学对比，结果显示，有3 株菌株表现为不同的微观形态，其中A1 为革兰氏阳性菌，属短杆菌，两端钝圆，成对，无芽孢。A2 为革兰氏阳性菌，属长杆菌，棒状，成对，无芽孢。A3 为革兰氏阳性菌，属中短型杆菌，两端钝圆，成对或链状排列，无芽孢。

2.2 分子生物学鉴定结果

通过通用引物对上述三株细菌16S rDNA 基因进行PCR 扩增并对产物进行测序鉴定，结果显示，除空白对照组外，均出现单一目的条带，经测序表明，A1 菌株16S rDNA 基因序列碱基数为1 469 bp，A2菌株16S rDNA 基因序列碱基数为1 450 bp，A3 菌株16S rDNA 基因序列碱基数为1 486 bp。

通过登录NCBI 网站进入BLAST 单元，导入上述3 种菌株16S rDNA 基因测序反馈序列，比对分析结果显示，A1 菌株与罗伊乳杆菌具有最高的相似度，A2 菌株与黏膜乳杆菌具有最高的相似度，A3 菌株则与植物乳杆菌具有最高的相似度。以上结果表明，本研究成功从鸡粪便中分离到3 株不同的益生菌菌株。

3 讨论

细菌耐药性一直以来均被视为世界卫生体系中较为重要的问题，同时对动物养殖业产生了较为严重后果[2]。本研究中对20 份粪便样品的分离鉴定结果发现，三株益生菌分别为不同实验组别中的优势菌群。该结果提示，益生菌菌群的构成较为复杂，正常肠道环境中并非仅有一种益生菌发挥作用，可能是多种，而益生菌群之间存在联系与否，还需深入研究。