柑橘果胶酯酶分离条件及生物学特性研究

王 晴，胡智慧，钱玉梅，李红侠，陈红玲，曹稳根

（宿州学院，安徽 宿州 234000）

0 引言

果胶酯酶是一种能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇的酶，广泛存在于植物中，常用于催化高甲氧基果胶脱去甲氧基，制备低甲氧基果胶以及用于果汁加工澄清中；果胶酯酶能够提高食品粘度，延长货架期，提高食品吸水性和稳定性；果胶酯酶还有脱苦、去除异味和水果果皮等用途，因此果胶酯酶具有广阔的开发前景［1-2］。柑橘皮和果肉中含有大量果胶酯酶［3-4］。本文以柑橘为原料，果胶酯酶活性为指标，采用单因素和正交试验优化柑橘果胶酯酶的分离条件，并对其热稳定性及受金属离子的影响进行研究，为果胶酯酶在食品工业中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘，产自湖南石门；果胶，郑州华安食品添加剂有限公司；氯化钠（NaCl）、氯化钙（CaCl2）、硫酸亚铁（FeSO4）、硫酸锰（MnSO2）、EDTA、氯化钾（KCl）、氯化钡（BaCl2）盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL20M 型高速冷冻离心机（广东天元实业集团股份有限公司）；HJ-3 型磁力搅拌器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；ZDDY-008 电位滴定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 柑橘果胶酯酶的提取及酶活测定

将柑橘剥皮、榨汁，按1:1 加入一定浓度的氯化钠，在一定的温度和pH 下提取一定时间，过滤，并在4 ℃下15000 r/min 离心30 min，取上清，即为柑橘果胶酯酶粗酶液，采用pH-strat 法测定柑橘果胶酯酶的酶活［5］。

1.3.2 单因素试验

在温度为35℃，pH 为7，NaCl 浓度为2.4 mol/L时，提取柑橘果胶酯酶0、5、10、15、20、25、30 h；在温度为35℃，pH 为7，NaCl 浓度分别为0、0.6、1.2、1.8、2.4、3 mol/L 时提取柑橘果胶酯酶20 h；在温度为35℃，pH为4、5、6、7、8、9、10，NaCl浓度为2.4 mol/L，提取20 h；在提取温度分别为10、15、20、25、30、35、40℃，pH 为7，NaCl 浓度为2.4 mol/L 时，提取20 h。测定各条件下酶活，探究各因素最佳水平。

1.3.3 正交试验设计

以柑橘果胶酯酶酶活为指标，选取温度、pH、NaCl 浓度和提取时间为试验因素，L（934）正交表来进行试验优化［6］，各因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平表

1.3.4 柑橘果胶酯酶生物学特性研究

1.3.4.1 柑橘果胶酯酶的热稳定性

将提取的果胶酯酶液分别放置在5、15、25、35、45、55 ℃条件下保存3 h 后，测其酶活。以最高酶活值为基准，计算相对酶活［7-8］。

1.3.4.2 金属离子对柑橘果胶酯酶酶活的影响

在酶液中分别添加2 mmol/L NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、BaCl2、MnSO4和EDTA 水溶液，常温下保存30 min，测酶活。以最高酶活值为基准，计算相对酶活［9-11］。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对柑橘果胶酯酶酶活的影响

由图1 可看出，提取时间越长，酶活越高，提取时间超过20 h，酶活开始下降，由此可见，提取时间不宜过长，否则会造成酶液出现失活现象，因此，选择最佳提取时间为20 h［12］。

图1 提取时间对柑橘果胶酯酶酶活的影响

2.1.2 NaCl浓度对柑橘果胶酯酶酶活的影响

由图2可见，随NaCl浓度上升，提取液中的柑橘果胶酯酶的酶活基本呈线性关系上升，NaCl 浓度为2.4 mol/L时，酶活最大，而后酶活开始急剧下降。果胶酯酶属于蛋白质，低浓度的Na+能够增加其溶解度，酶量增大，但Na+的浓度超过一定值之后，果胶酯酶就会盐析沉淀，使得提取液中的酶量下降，酶活降低［3］。所以最佳NaCl浓度选为2.4 mol/L。

图2 NaCl浓度对柑橘果胶酯酶酶活的影响

2.1.3 pH值对柑橘果胶酯酶酶活的影响

从图3可知，pH小于6时，果胶酯酶的酶活随着pH 的升高缓慢增加，pH 大于6 时果胶酯酶的酶活随着pH 增大急剧上升，当pH 为7 时酶活最大，pH超过7 时，酶活又开始下降。根据试验观察，pH 大于7，溶液中有少量沉淀析出，可能此时接近其等电点，开始有少量蛋白酶析出，导致酶活下降。所以，提取果胶酯酶的最适pH值为7。

图3 pH对柑橘果胶酯酶酶活的影响

2.1.4 提取温度对柑橘果胶酯酶酶活的影响

由图4 可以看出，在10～20 ℃时，果胶酯酶的酶活基本不变，20～35 ℃时，随温度的上升，提取液中柑橘果胶酯酶的酶活呈急剧增长的趋势，当超过35 ℃以后随温度上升呈下降趋势，可见温度对果胶酯酶的提取影响较大，原因可能与酶的最适作用温度有关，低温条件下，可能酶的活性较低，提取液中的酶活量较少，温度过高反而会抑制酶活性。因此，最适提取温度选用35 ℃。

图4 提取温度对柑橘果胶酯酶酶活的影响

2.2 正交试验结果

由表2 可见，各因素主次顺序为C＞B＞D＞A，柑橘果胶酯酶提取的最优条件组合为A3B3C2D3，即最佳的提取条件为pH 为7.5、提取时间为23 h、提取温度38 ℃、NaCl浓度2.8 mol/L。按照最优条件进行验证试验，测出酶活为（0.94±0.03）μmol/min·mL，说明了该方法可靠，因此可选为优化柑橘果胶酯酶的最佳提取工艺条件。

表2 正交试验结果

2.3 柑橘果胶酯酶的生物学特性

2.3.1 柑橘果胶酯酶热稳定性

从图5 中可以看出，柑橘果胶酯酶的耐热性较差，在不超过15℃时保存3 h 后相对稳定，其相对酶活能够保持在75%以上，高于15 ℃之后的相对酶活就逐渐下降，而在超过55 ℃时保温3 h 以后柑橘果胶酯酶活性几乎全部丧失。

图5 柑橘果胶酯酶热稳定性

2.3.2 金属离子对柑橘果胶酯酶酶活的影响

由图6 可以看出，Ca2+、Na+、K+和Fe2+对果胶酯酶有明显的促进作用，其中Ca2+促进效果最好；Ba2+、Mn2+和EDTA 对果胶酯酶却有抑制作用，其中EDTA对果胶酯酶的抑制作用较大，酶活仅有20%。

图6 金属离子对柑橘果胶酯酶酶活的影响

3 结论

通过单因素和正交试验，探究NaCl 浓度、pH、提取温度、提取时间对柑橘果胶酯酶活的影响，确定了最佳提取条件：NaCl 浓度为2.8 mol/L、pH 为7.5、提取温度为38℃、提取时间为23 h时，此时柑橘果胶酯酶酶活最高，为（0.94±0.03）μmol/min·mL。该酶热稳定性较差，金属离子Ca2+、Na+、K+和Fe2+对柑橘果胶酯酶具有激活作用，而Ba2+、Mn2+和EDTA对柑橘果胶酯酶起抑制作用。本研究可为柑橘果胶酯酶的提取及应用提供理论依据。