结肠癌中SIX2 基因的表达及预后的生物信息学分析

许源民 徐阿曼（通讯作者）

( 安徽医科大学第一附属医院普外科 安徽 合肥 230032）

前言

尽管全球医学发展迅速，癌症的发病率和死亡率依然上升很快，其中结肠癌的发病和病死率在所有癌症中排名较高[1]。早期结肠癌患者可以通过手术治愈，但晚期结肠癌患者多伴有复发转移，其5 年生存率低于10%[2-3]。随着化疗和靶向药物的使用，结肠癌患者的总生存率显著高于以前。因此，寻找结肠癌早期诊断的分子生物学标志物和治疗靶点可能成为进一步提高结肠癌生存率的主要研究方向，尽管癌胚抗原（CEA）在结肠癌诊断中有着广泛的应用[4-5]。仍然需要寻找更多有效的生物标志物。

SIX2 是SIX 家族6 个转录因子的成员之一，在多种胚胎组织的发育过程中起着重要作用[6]。先前的研究[7]表明SIX2 在肾脏形成中具有重要意义。近年来，一些证据表明SIX2 与不同类型的癌症相关[8-10]。Song 等人的研究[8]提示SIX2 可作为肾母细胞瘤的诊断和预后标志物。Liu 等人的研究[9]表明SIX2 与非小细胞肺癌（NSCLC）患者生存率降低有关。最近，有文章指出SIX2 与肝细胞癌预后不良有关[10]。然而，SIX2 在结肠癌中的作用和机制仍不清楚。

本目的是利用癌症基因组图谱（TCGA）中的数据评估SIX2对结肠癌患者预后的影响。分析了SIX2 的表达对结肠癌患者临床病理特征和总生存率的影响，得出结论：SIX2 的表达增加与结肠癌患者预后不良有关。经Logistic 回归分析，SIX2 表达与肿瘤分期、浸润深度（T）、淋巴结转移（N）（P=0.002）和远处转移（M）明显相关。Cox 回归分析显示SIX2 表达可能是结肠癌独立的预后因素,据此绘制列线图来预测结肠癌患者的1 年、3 年和5 年生存率。

1.材料和方法

1.1 数据来源和方法

2019 年11 月，从基因组癌图谱网站检索结肠癌患者的RNA测序数据（41 个正常组织和473 个肿瘤组织）和临床资料（459例）。使用R 语言（v.3.5.1）和Perl 语言（v.5.30.0.1）从数据集中提取相关信息。通过与正常组织比较，分析SIX2 在肿瘤组织中的表达。根据TCGA 标本id，将肿瘤组织与正常组织进行配对，并比较SIX2 在同一标本结肠和正常组织中的表达水平。根据459 例结肠癌患者的临床资料与SIX2 基因的表达量，采用logistic 回归和多因素Cox 回归分析。列线图是肿瘤学中广泛使用的一种预测工具，特别是对癌症预后的预测有重要意义。列线图用来预测结肠癌患者的1 年、3 年和5 年生存率。

1.2 统计学处理

所有统计分析均使用R（v.3.5.1）完成。采用Wilcoxon秩和检验比较正常组织和肿瘤组织中SIX2 表达的差异。用logistic 回归和Wilcoxon 秩和检验确定SIX2 表达与临床病理特征的相关性。应用Cox 回归和Kaplan-Meier 方法分析临床病理特征与预后的关系。

2.结果

2.1 SIX2 在正常和肿瘤组织中的表达差异

如图1（A-B）所示，散点图显示正常组织（n=41）和肿瘤组织（n=473）之间SIX2 的差异表达。值得注意的是，与同一样本的正常组织相比，SIX2 在肿瘤组织中的表达显著上调，提示SIX2 的过度表达可能与结肠癌的发生有关。

2.2 结肠癌患者的临床信息

459 例结肠癌患者诊断时的中位年龄为68 岁。其中男性243 例，女性216 例。13 例曾接受放射治疗，163 例接受药物治疗。此外，68 例患者AJCC 分期为Ⅰ期，166 例为Ⅱ期，146 例为Ⅲ期，65 例为Ⅳ期，其中T1 期肿瘤11 例，T2 期肿瘤78 例，T3 期肿瘤313 例，T4 期肿瘤56 例。淋巴结转移率为41.2%（n=189），远处转移率为16.4%（n=67）。其中357 例仍然存活。

2.3 SIX2 的表达与临床特点的关系

表1 显示SIX2 的表达与患者的年龄、种族、性别无显著相关性（P 均＞0.05）。Logistic 回归分析同样显示SIX2 的表达增加与肿瘤分期、肿瘤浸润深度（T）、淋巴结转移（N）和远处转移（M）显著相关。具有相关性。以上结果表明，SIX2 的过度表达可能有助于结肠癌的发生和转移。见表1。

2.4 生存分析及多因素Cox 分析

所有结肠癌患者根据SIX2 的中位表达水平分为高表达组和低表达组。如图1C 所示，Kaplan-Meier 曲线显示SIX2 的高表达可预测结肠癌患者预后不良（P=0.018）。多因素分析结果显示，SIX2表达与生存时间显著相关（危险比[HR]：1.83；95%可信区间[CI]：1.14-2.9；P=0.012），提示SIX2 表达是结肠癌患者一项独立的预后因素。其他一些临床病理特征，如年龄、药物治疗、肿瘤浸润深度（T）和淋巴结转移（N），也与预后不良有关（图1D）。

2.5 列线图预后模型的建立

如图1D 所示，年龄、药物治疗、肿瘤浸润深度（T）、淋巴结转移（N）和SIX2 的表达与结肠肿瘤患者的预后显著相关，这些变量可能是结肠肿瘤患者预后的独立预后因素。据此绘制列线图来预测结肠癌患者的1 年、3 年和5 年生存率（图1E）。根据多因素分析中的显著性因素进行评分，根据总评分预测生存率。

图1 SIX2 在正常组织和肿瘤组织中的表达差异（A-B）;SIX2 表达对结肠癌患者生存率的影响（C）临床病理特征与结肠癌患者预后的多因素Cox 分析（D）;构建列线图生存模型(E)

3.讨论

SIX2 最近被报道与不同类型的癌症有关。Hou 等人[11]使用 qRT-PCR 法检测NSCLC 中SIX2mRNA 的表达，Western blot 和免疫组化法检测SIX2 蛋白水平。他们发现，与正常组织相比，NSCLC 中SIX2 的表达水平显著上调。然而，SIX2 在结肠癌中的作用及其机制尚未得到很好的了解。从TCGA 中下载高通量RNA 测序数据，利用生物信息学方法进行分析。结果表明，SIX2 在结肠癌组织中的表达显著高于正常组织，与肿瘤分期、浸润深度、淋巴结转移及远处转移密切相关。此外，我们发现SIX2 的mRNA 表达增加提示患者不良的预后，表明SIX2的过表达可能促进结肠癌的发生和发展。因此，我们认为SIX2 的表达水平可以作为结肠肿瘤的潜在生物标志物和治疗靶点，是结肠肿瘤患者预后不良的独立因素。

然而，由于缺乏实验证据和临床数据的验证，目前的生物信息学研究存在一些潜在的局限性。为了验证我们的结论，还需要进一步的实验与研究。