烟台苹果多酚的提取、分离及纯化

李文前 董涵 张肖思睿 张振炜 刘序彦

摘   要：为分析烟台各县区7个示范果园的红富士苹果中多酚组成，文章采用微波辅助法提取苹果中多酚，福林—酚比色法和铁盐催化法分别测定总酚及原花青素含量。结果表明，各鲜果中总酚含量为2.39～3.00 mg/g，原花青素含量占比在总酚中的含量在11.0%～12.4%。其中以烟台栖霞区红富士苹果为最佳。经Sephadex G25精制后苹果多酚总酚得率为0.25%。烟台红富士苹果多酚含量高，营养丰富，食用和药用价值良好。对于烟台苹果的深加工和提升附加值具有一定的的理论意义和应用价值。

关键词：烟台苹果;微波提取;多酚;原花青素

苹果多酚是植物多酚的一种，是苹果中所含多元酚类物质的通称，在皮、肉和核中都存在。化学性质和生理功能性质稳定，可在室温下长期保存，其易溶于水和乙醇，产品可进行深加工，营养价值和医疗价值都很高。研究表明苹果中的酚类物质主要包括：类黄酮、绿原酸、儿茶素等。利用“苹果多酚”的抗氧化作用可以对抗紫外线照射后产生的活性氧的危害，保护美丽肌肤。另外，对于黑色素生成，肌肤美白也有一定作用。同时，苹果多酚化合物还可以通过诱导细胞的“自杀”作用，抑制细胞增殖和肿瘤增大，并发现原花青素是苹果多酚化合物中抗癌的有效成分，用于牙膏中，既有防蛀齿作用又有洁齿作用，同时其有抑制高血压、高血脂及心脑血管疾病的作用，是有效的高血压、高血脂及心脑血管疾病的制药剂。被人誉为是“天然降压药”，因此对苹果多酚的提取、分离及纯化方面的研究具有一定的价值。

我国是重要的苹果生产国，其中山东烟台地区的苹果栽培历史悠久，是中国苹果栽培最早的地方，有140多年的历史，被称为中国现代苹果的发源地。烟台气候和环境条件非常适宜苹果生长，被农业部确定为中国苹果优势产区，烟台苹果以“果形端正、色泽艳丽、果肉甜脆、香气浓郁”享誉国内外。以烟台辖区内的长岛、龙口、栖霞、莱阳、莱州、蓬莱、招远等地栽培的苹果为烟台市的区域公用品牌。但是对烟台苹果多酚的进一步提取纯化及含量研究未见报道。

因此，本文通过微波提取技术对烟台7个有代表性的县区苹果的多酚及原花青素含量进行测定和对比分析，为烟台苹果多酚的产业化提供数据参考，对于烟台苹果的深加工和提升附加值具有一定的理论意义和应用价值。

1    材料与方法

1.1  材料与仪器

山东烟台红富士苹果分别购买于烟台辖区内的长岛、龙口、栖霞、莱阳、莱州、蓬莱、招远，编号01—07。陕西洛川红富士编号08用以做对比。没食子酸标准品购买于上海源叶生物科技有限公司、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、Folin-ciocalteui试剂（自制：在1l磨口回流蒸馏器中加入100 g钨酸钠（Na2WO4），25 g钼酸钠Na2MoO4），700 mL蒸馏水，50 mL 85%磷酸，100 mL 37%盐酸（HCl），冷凝回流10 h，然后添加150 g硫酸锂（Li2SO4）和数滴溴液（Br2），取下冷凝管，重新加热至沸，维持15 min，除去多余溴，冷却后补足蒸馏水至1 000 mL，用棕色试剂瓶装好，置于冰箱中长期冷藏备用，临用时稀释3倍）。

1.2  方法

1.2.1  多酚提取

准确称取苹果渣2.0 g于250 mL锥形瓶中，采用微波提取，提取条件：萃取时间60 s;功率750 W;乙醇浓度60%;料液比1：50。提取后4 000 r/min，20 min离心，取上层离心液定容到50 mL。

1.2.2  总酚含量测定

以没食子酸为标准物质，采用福林—酚比色法测定苹果中总酚的含量。

测定方法根据参考文献修改如下：准确称量干燥至恒重的没食子酸标准品0.1 g，配制成浓度为100 μg/mL的标准液。分别量取1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0 mL，7.0 mL没食子酸标准液于25 mL棕色容量瓶中，然后分别加入福林—酚试剂1.0 mL，混匀后加入10%碳酸钠溶液5.0 mL，充分混匀，定容到25 mL，30 ℃遮光反应1 h，于765 nm测定吸光值，绘制没食子酸标准曲线y=0.022 5x+0.006 1，R?=0.998 2。

1.2.3  样品测定

量取多酚提取液2 mL于25 mL棕色容量瓶中，按照标准曲线测定方法，测定苹果多酚含量。

1.2.4  苹果提取物中原花青素含量的测定

将1.2.1中配置好的2 mL多酚提取物，用甲醇溶解后定容至25 mL，然后取1 mL样液加入具塞试管中，再依次加入6 mL正丁醇/盐酸溶液（体积比为95/5），0.2 mL硫酸铁铵溶液（0.024 g/mL），于沸水中加热40 min后迅速冷却，以试剂空白作参比，然后在546 nm处测定其吸光度。

1.2.5  葡聚糖凝胶Sephadex G25预处理

Sephadex G25属于分子筛凝胶，具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质，适合于不同类型有机物的分离，并且性质稳定，易实施循环操作。

样液上柱后用蒸馏水洗脱，流速1 mL/min，每4 min收集一次洗脱液，1～10为水洗液，10管后采用70%的乙醇以0.5 mL/min的流速进行洗脱，每管按照0.5 mL/min的量收集洗脱液，然后逐管分别进行多酚的测定。

2    结果分析

2.1  总酚质量分数

如图1所示，烟台7个县区（01～07）样果中鲜果苹果多酚质量分数为2.388～2.998 mg/g，与08陕西洛川红富士苹果对比分析可知，烟台红富士苹果中总体多酚质量分数较高，其中栖霞区苹果多酚质量分数最高为2.998 mg/g。

2.2  原花青素質量分数

如图2所示，在烟台红富士（01—07）苹果中原花青素质量分数在0.278～0.372 mg/g，由表3可知原花青素在总酚中的占比为11.0%～12.4%，其中栖霞（03）红富士总酚中原花青素质量分数最高达到12.4%，陕西洛川（08）红富士总酚中原花青素质量分数可达12.2%。因为原花青素有一定的抗氧化性以及医用价值，为烟台苹果多酚中单体的提取和纯化提供了一定的理论依据。各区原花青素在总酚中的占比如表1所示。

2.3  苹果多酚的精制

结果如图3所示，从中可以看出比较明显的峰有8个，其中最早出现的峰多酚含量较少，自18管之后多酚的含量明显增加，18～42管之间为多酚分布的高峰区间，合并18管之后的洗脱液进行含量测定。经Sephadex G25精制后的苹果多酚，经冷冻干燥处理得到产品苹果多酚粉末，苹果多酚总酚得率为0.25%。

3    结语

文章研究了山东烟台7个地区红富士苹果的多酚及原花青素质量分数，从实验中可知烟台区红富士苹果中多酚质量分数为2.388～2.998 mg/g，原花青素质量分数占比在总酚中的质量分数在11.0%～12.4%，其中栖霞（03）红富士总酚和原花青素质量分数最高分别为2.998 mg/g和12.4%。与洛川（08）红富士苹果对比可知，烟台红富士因其栽培苹果历史悠久，水土、气候等条件利于苹果的生长所以其总酚质量分数明显高于洛川红富士，但是二者中原花青素含量占比都很高可达12%左右。经Sephadex G25精制后的苹果多酚总酚得率为0.25%。