1株热带海洋光合细菌的筛选、鉴定及水质净化能力

张秀霞 王冬梅 李军涛 胡永华 郑佩华 鲁耀鹏 冼健安

摘要：从西沙群岛永兴岛滩涂底泥中，通过富集分离纯化得到1株光合细菌（编号YX-1），对菌株进行形态观察和生理生化特性分析，经16S rDNA鉴定为红假单胞菌。将该菌株接种到模拟富营养化养殖污水中，结果显示该菌株具有较强的COD、氨氮和亚硝酸盐去除能力，优于阳性对照菌株，可开发应用于海南水产养殖污水的净化处理。

关键词：光合细菌;分离;养殖污水;净化

中图分类号：S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）04-0278-04

收稿日期：2018-12-05

基金项目：农业农村部财政专项（编号：NFZX2018）;天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金（编号：TJAE201808）。

作者简介：张秀霞（1982—），女，广东梅州人，硕士，工程师，主要从事水产健康养殖研究。E-mail：107265834@qq.com。

通信作者：冼健安，博士，副研究员，主要从事水产养殖生态及毒理学、水产动物营养与饲料学研究。E-mail：xian-ja@163.com。

光合细菌（photosynthetic bacteria，PSB）是一类具有光合色素、能在无氧条件下进行光合磷酸化的微生物，分布广泛，遍及江河、沼泽、湖泊、海洋、池塘及活性污泥和土壤中[1]，易培养，生长速度快，繁殖力和生命力强，与自然界的C、N、S化学循环有重要关系，在自然界自我净化过程中担负着重要角色，在污水净化、水产养殖、保健品研发、产氢、农业等多方面得到广泛应用[2-3]。PSB最初被应用于处理有机污水，后来逐渐引入应用到水产养殖当中。PSB在水产养殖上的研究和应用主要集中在调控、改善和稳定养殖水体的水质[4]，防治疾病的发生及利用PSB作为生物饵料和营养性添加剂[5-6]。

本研究从西沙群岛永兴岛滩涂底泥中富集并分离筛选出1株光合细菌菌株，对其形态学和生理生化特性进行了分析，并对其在模拟的富营养化对虾养殖污水中的净化效果进行了研究，为其进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

试验使用饲料为本实验室自制对虾饲料，阳性对照菌为市售光合细菌产品。

1.1.2 试验试剂

PCR扩增试剂购自TaKaRa公司，其他试剂购自广州化学试剂厂。

1.1.3 培养基配方

1.1.3.1 富集培養基

NaCl 2.00 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、NH4Cl 1.00 g、NaHCO3 2.00 g、KH2PO41.75 g、CH3COONa 3.00 g、酵母膏1.00 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0[7]。

1.1.3.2 分离培养基

培养基成分见表1，按上储备液A、B、D、E配制好后用2 mol/L氢氧化钠溶液调pH值为7.0，置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃，灭菌20 min，若配固体培养基则再添加2%琼脂粉，储备液C、 F使用时在无菌超净工作台中用0.22μm针孔过滤器过滤后加入。

1.2 方法

1.2.1 分离纯化

样品底泥加无菌生理盐水重悬浮，1 000 r/min离心2 min，取出上清液6 000 r/min离心5 min，去上清，将沉淀采用无菌富集培养基重悬浮培养，液面加无菌液体石蜡覆盖，密闭瓶口，于30 ℃，光照强度为2 500～3 000 lx光照培养箱中培养。培养至液体变成红色或者底部有红褐色絮状物出现，将培养液装入无菌离心管，6 000 r/min离心5 min，沉淀采用富集培养基重悬浮后至培养箱中培养。重复上述培养步骤3次。将富集液梯度稀释后取培养液在固体分离培养基上涂布，采用双层平板法[8]多次纯化分离出纯种菌株。

1.2.2 形态观察和生理生化特性分析

将纯化的菌株接种于分离培养基培养，参照《伯杰细菌系统鉴定手册》[9-10]和《常见细菌系统鉴定手册》[11]对菌株进行形态观察和生理生化特性分析。

1.2.3 16S rDNA鉴定

取纯化的单菌落作为DNA模板，采用16S rDNA通用引物（上海生工生物工程有限公司合成），进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，送华大基因测序。测序结果在GenBank进行比对，下载相似序列构建系统发育树。

1.2.4 水质净化能力分析

采用本实验室自制的对虾饲料7 g，加入200 mL海水，浸泡1 h，采用滤纸过滤，收集过滤液体。取室内对虾养殖污水与饲料浸出液按9 ∶1比例进行混合，每瓶分装400 mL，进行高压灭菌。将提前培养至菌浓度为108个/mL的菌液50 μL加入灭菌培养液中，空白对照组加入50 μL 灭菌培养液，阳性对照组加入50 μL市售光合细菌菌液，然后置于光照培养箱中培养，每天取样测定COD、氨氮和亚硝酸盐含量。

2 结果与分析

2.1 光合细菌形态及生理生化特性

富集得到棕红色菌液，采用双层平板法反复分离，挑单菌落至液体分离培养基中，待液体分离培养基中得到红色菌液，最终分离出菌株1株，编号为YX-1。该菌株菌落小，卵形或短杆形，边缘平整，表面光滑湿润，培养48 h为白色菌落，密封培养至10 d时菌落会长出棕红色色素（图1）。经检测为革兰氏阴性菌，菌液光照足时为棕红色，光照不足时菌液成棕黄色且菌体下沉。

由YX-1菌株的生理生化特性分析（表2）可知，该菌株为兼性厌氧菌，在缺氧环境生长更好，能利用大多数糖类，不能利用甘油作为碳源，淀粉水解阴性，明胶液化阴性，含鸟氨酸脱羧酶，不含赖氨酸和精氨酸脱羧酶，不能利用尿素作为氮源，吲哚试验阳性，硫化氢、硝酸盐还原阴性，含有接触酶、氧化酶。

综合菌落形态、培养方式、革兰氏染色及各项生理生化指标，初步判定该菌株为光合细菌。

2.2 16S rDNA序列分析

测序比对结果（图2）显示，YX-1菌株与Rhodopseudomonas红假单胞菌属各模式菌株的相似性高达98%以上，在进化树中与Rhodopseudomonas faecalis聚为1个分支，可判定YX-1 菌株為红假单胞菌属的菌株。

2.3 水质净化能力分析

2.3.1 COD去除能力

由图3可知，空白对照组COD值基本保持稳定，随着时间的延长，YX-1菌株试验组与阳性对照组的COD值不断下降;培养5 d 后，由图4可知，YX-1菌株试验组COD去除率显著高于阳性对照组和空白对照组（P<0.05）。

2.3.2 氨氮去除能力

由图5可知，空白对照组氨氮含量基本保持稳定，随着时间的延长，YX-1菌株试验组与阳性对照组的氨氮含量不断下降;由图6可知，培养5 d后，YX-1菌株试验组氨氮去除率显著高于阳性对照组和空白对照组（P<0.05）。

2.3.3 亚硝酸盐去除能力

由图7可知，空白对照组亚硝酸盐含量基本保持稳定，随着时间的延长，YX-1菌株试验组与阳性对照组的亚硝酸盐含量不断下降;由图8可知，培养3 d后，YX-1菌株试验组的亚硝酸盐去除率已达到100%，显著高于阳性对照组和空白对照组（P<0.05）。

3 讨论

从海南西沙群岛永兴岛滩涂淤泥中分离的光合细菌YX-1，经细胞形态、菌落形态、培养特性、生理生化特性分析及16S rDNA鉴定，判定为红螺菌科红假单胞菌属。通过序列比对发现其与Rhodopseudomonas faecalis相似性达99%，但YX-1菌株的部分生长特性与文献报道[12]有一定的差异，因此不排除YX-1为Rhodopseudomonas新种的可能性。

Rhodopseudomonas与深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）、球形红微菌（Rhodomicrobium sphaeroides）等是目前研究较多的产氢光发酵细菌，普遍存在产氢和固氮作用，已被广泛应用于有机废水的生物处理[13]。本研究筛选的YX-1菌株来源于热带海水环境，具有耐高温、耐盐、耐碱性等特性，本研究结果表明其具有较强的亚硝酸盐、COD和氨氮去除能力，作为海南水产养殖过程中的水质改良剂，该菌株具有较高开发应用价值。

参考文献：

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[2]Vignais P M，Colbeau A，Willison J C，et al. Hydrogenase，nitrogenase，and hydrogen metabolism in the photosynthetic bacteria[J]. Advances in Microbial Physiology，1985，26（10）：155-234.

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[11]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：349-399.

[12]刘冰峰. 光发酵细菌的选育及其与暗发酵细菌耦合产氢研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2009.

[13]谢国俊. 光发酵细菌Rhodopseudomonas faecalis RLD-53产氢效能与强化机制研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2013.