植物乳杆菌发酵培养基优化及工艺开发

范佳硕，杨 鑫，陈 博，卢宗梅，陈 影，乔龙江，杨 硕，李 义,3，佟 毅,3

(1.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209；2.中粮生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；3.玉米深加工国家工程研究中心， 吉林 长春 130033；4.中粮生物科技(北京)有限公司，北京 102209；5.北京市畜产品质量安全源头控制工程技术研究中心，北京 102209)

益生菌是一类能够对宿主产生益处的活性微生物，可以定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，发挥有益作用[1]。乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌[2]，乳酸在调味品中应用广泛，是食品工业中普遍使用的酸味剂[3-4]。这类细菌在自然界中分布极为广泛，具有丰富的物种多样性[5]，它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上也具有重要的学术价值，在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高[6]。植物乳杆菌与我们的生活有着密切联系，它可以定植于人体肠道，与肠道微生物有着密切联系[7-8]。益生菌对人体的益处包括：维持肠道菌种平衡，促进营养物质的吸收，提高矿物质和铁的利用率[9-11]；抑制肿瘤细胞增长，预防癌变[12-13]；降低血液中胆固醇含量以预防心血管疾病[14]。近年来，研究发现一些乳酸菌具有重要的生物学功能，如抗衰老、体内体外的抗氧化活性[15]，增强机体免疫力[16-17]等。笔者从大曲中分离筛选到一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，在单因素实验的基础上通过响应面法优化发酵培养基，通过1 L发酵罐实验进一步优化发酵条件，为该菌株的发酵生产提供基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

植物乳杆菌BC00171来源于中粮营养健康研究院有限公司。

1.1.2 培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸镁0.1 g/L，醋酸钠5 g/L，柠檬酸铵2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温80 1 mL/L。

1.1.3 实验仪器

KG-SX-700蒸汽灭菌锅，日本ALP公司；2160液相色谱仪，美国安捷伦公司；UV-1750分光光度计，德国Eppendorf公司；B1-150A恒温培养箱，施都凯仪器设备有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 单因素实验优化培养基配方

通过单因素实验设计对培养基碳源氮源进行筛选优化，碳源选用葡萄糖，质量浓度梯度分别为25，20，15，10 g/L；氮源选用酵母浸粉和牛肉膏[18]，酵母浸粉与葡萄糖质量浓度比为3∶2，牛肉膏质量浓度为0，5 g/L。对比培养20 h后的活菌数差别。

1.2.2 葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏响应面法验证最优浓度

通过响应面的方法对单因素实验的碳氮源进行验证实验，选取葡萄糖作为植物乳杆菌的唯一碳源，酵母浸粉和牛肉膏作为氮源，质量浓度范围分别是：葡萄糖15～25 g/L，酵母浸粉5～30 g/L，牛肉膏0～5 g/L。应用Box-Behnken实验设计三因素响应面实验。并以培养20 h的活菌数作为响应值。响应面实验设计因素水平和编码如表1所示。

表1 响应面实验设计因素水平和编码Table 1 Response surface experimental design

1.2.3 发酵罐发酵工艺优化实验

在单因素实验和响应面验证实验的基础上对植物乳杆菌BC00171进行发酵罐发酵工艺优化实验，对pH调控方式、接种量等条件进行优化[19]，得到植物乳杆菌最优发酵工艺。

1) pH调控方式对植物乳杆菌发酵的影响

在单因素和响应面实验优化的培养基基础上进行发酵工艺优化实验，首先对pH调控方式进行优化，分别选择pH不调控、加入15 g/L碳酸钙、加入氨水维持pH为6.8这3种调控方式进行发酵实验。每隔2 h取样，检测活菌数及发酵液上清乳酸含量和葡萄糖剩余量，根据葡萄糖的消耗速率及乳酸的生成速率对培养基的浓度进行相应更改。计算方式为

2) 接种量对植物乳杆菌发酵的影响

按照优化的培养基配方及工艺条件对接种量进行优化，分别选择3种接种量(3.0%，1.7%，0.4%)进行实验，检测发酵过程中的活菌数。

1.3 分 析

应用高效液相色谱(HPLC)检测法对实验过程中消耗的葡萄糖含量及产生的乳酸含量进行检测，并对发酵不同时间的样品进行取样，梯度稀释法进行活菌数检测。

2 结果和分析

2.1 单因素实验优化培养基配方

选用葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏进行单因素实验，实验结果如表2所示。

表2 不同培养基发酵20 h后活菌数及乳酸产量Table 2 Number of viable bacteria and yield of lactic acid after fermentation in different medium for 20 h

由表2单因素验证实验结果可知：牛肉膏对植物乳杆菌活菌数、乳酸产量没有明显的影响；同样的酵母浸粉、葡萄糖比例下，提高牛肉膏质量浓度，活菌数、乳酸产量没有随之提高；葡萄糖质量浓度为20 g/L、酵母浸粉为30 g/L、牛肉膏不添加时，活菌数达到最高3.9×109CFU/mL，乳酸产量为11 g/L。

2.2 响应面法验证葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏最优质量浓度

响应面实验设计方法及结果如表3所示。

表3 响应面实验设计方法及结果Table 3 Response surface experiment design method and results

以培养20 h的发酵液活菌数为响应值对响应面结果进行统计，分析葡萄糖、酵母浸粉质量浓度对活菌数的影响，牛肉膏质量浓度保持2.5 g/L，如图1所示。

图1 葡萄糖、酵母浸粉质量浓度对活菌数影响的曲面图Fig.1 Surface diagram of the effect of glucose and yeast extract concentration on the viable count

以培养20 h的发酵液活菌数作为响应值对响应面结果进行统计分析牛肉膏、酵母浸粉质量浓度对活菌数影响，其中葡萄糖质量浓度保持值为20 g/L，结果如图2所示。

图2 牛肉膏、酵母浸粉质量浓度对活菌数影响的曲面图Fig.2 Surface diagram of the effect of beef extract and yeast extract concentration on the viable count

以培养20 h的发酵液活菌数作为响应值对响应面结果进行统计分析牛肉膏、葡萄糖质量浓度对活菌数影响，其中酵母浸粉质量浓度保持值为17.5 g/L，结果如图3所示。回归方程方差分析如表4所示，表中SS为离均差平方和，MS为均方，F为统计量。由图1～3及表4可知：酵母浸粉对植物乳杆菌生长是显著相关(P=0)，葡萄糖、牛肉膏对植物乳杆菌生长是显著不相关(P>0.05)。根据响应面实验结果，最佳方式为酵母浸粉质量浓度30 g/L，葡萄糖质量浓度20 g/L，牛肉膏不添加。

图3 牛肉膏、葡萄糖质量浓度对活菌数影响的曲面图Fig.3 Surface diagram of the effect of beef extract and glucose concentration on the viable count

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

① *表示交互作用。

2.3 发酵罐发酵工艺优化实验

2.3.1 pH调控方式

根据单因素实验及响应面实验结果可知当碳源质量浓度为20 g/L时，发酵终点的乳酸产量为11 g/L，即葡萄糖并没有完全利用，因此发酵罐降低碳源浓度选取15 g/L进行实验。对15 g/L葡萄糖在不同pH调控方式下的活菌数进行比较，结果见表5。

表5 15 g/L葡萄糖在不同pH调控方式下的活菌数比较Table 5 Comparison of viable counts of 15 g/L glucose under different pH control modes

不同PH调控方式下葡萄糖及乳酸质量浓度如图4所示。15 g/L葡萄糖在发酵8 h时消耗完，两组pH调控组的乳酸生成速率明显高于不调控pH组，因此，pH的调节明显提高了植物乳杆菌对葡萄糖的代谢速率。实验显示葡萄糖的耗尽带来发酵液pH的上升，添加碳酸钙调控pH一组中碳酸钙随着植物乳杆菌乳酸的形成转变为乳酸钙，pH维持在5.3左右，不调控pH组终点pH为4.1，因此，培养基葡萄糖含量不足，将在葡萄糖高浓度下对pH进行调控。对40 g/L葡萄糖在不同pH调控方式下的活菌数比较，比较结果见表6。

图4 不同pH调控方式下葡萄糖及乳酸质量浓度Fig.4 Glucose and lactic acid contents under different pH regulation modes

表6 40 g/L葡萄糖在不同pH调控方式下的活菌数比较Table 6 Comparison of viable counts of 40 g/L glucose in different pH control modes

对40 g/L葡萄糖下不同pH调控时葡萄糖及乳酸质量浓度进行测试，结果如图5所示。

图5 40 g/L葡萄糖下不同pH调控葡萄糖及乳酸质量浓度Fig.5 Glucose and lactic acid contents were regulated by different pH under 40 g/L glucose

由图5可知：不调控pH组仅能消耗20 g/L葡萄糖且生长缓慢；碳酸钙调控pH组葡萄糖消耗速率为2.5 g/(L·h)，发酵16 h后将葡萄糖全部消耗完且此时活菌数达到最高；pH维持6.8的组葡萄糖消耗速率为4 g/(L·h)，发酵10 h，葡萄糖被消耗完，活菌数在发酵12 h时达到最高。添加碳酸钙组延缓了发酵过程但是活菌数仍可达到与pH维持6.8的组同样的数量级，故可根据不同的发酵需求，选择不同的pH调控方式。

2.3.2 接种量对植物乳杆菌发酵的影响

按照优化的培养基配方及工艺条件对接种量进行优化，分别选择3.0%，1.7%，0.4% 3种接种量进行实验，分别检测培养6，8，10，12，14，16，20 h发酵过程中的活菌数，结果见表7。接种量的降低，直接降低了活菌数，选择3%接种量可以保证活菌数达到最高。

表7 不同接种量的活菌数比较Table 7 Comparison of viable counts of different inoculations

3 结 论

植物乳杆菌在免疫调节、降低胆固醇以及对肠道菌群的调节、抗衰老等方面有着十分显著的影响，将其进行工业化生产必定能为人类健康问题带来光明。笔者应用Box-Behnken实验设计和响应面法对葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏的质量浓度进行了优化，并利用1 L发酵罐对发酵条件进行研究，最终得到植物乳杆菌BC00171摇瓶的最优培养基配方，在此培养基配方下发酵20 h后活菌数达到109CFU/mL。通过对发酵罐发酵工艺进行优化后得到发酵罐最优培养基，在此配方条件下，按照接种量3%，发酵过程中控制pH为6.8，发酵12 h后活菌数即可达到百亿，不仅提高了活菌数还大大缩短了发酵周期。