新疆彩色棉品种指纹图谱构建与遗传多样性分析

2020-04-15李婧慧李淑琴朱波曹阳金彦龙乔艳清张新宇孙杰薛飞

中国棉花 2020年3期

李婧慧，李淑琴，朱波，曹阳，金彦龙，乔艳清，张新宇，孙杰，薛飞*

（1.石河子大学农学院/ 新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子832003；2.新疆生产建设兵团第五师农业科学研究所，新疆双河833408 ）

天然彩色棉是1 种在吐絮时期棉纤维便带有绿色、棕色等颜色的棉花。我国是世界上最大的天然彩色棉生产国[1-2]，新疆是世界上种植彩色棉面积最大的地区，产量占世界总产量的50%左右，约占国内彩色棉总产量的95%[3-4]。近年来，环境污染问题和可持续发展备受关注，未受漂白剂、染料腐蚀，绿色健康的天然彩色棉，在透气性、吸汗性、抗静电等方面的优势，受到广大消费者的喜爱[5-6]。市场对天然彩色棉需求量持续增加，然而一些不法商贩为追求高额利润，用白色棉冒充彩色棉，造成天然彩色棉市场鱼目混珠，影响消费者切身利益，侵犯育种者品种权[7]。因此，建立1 套可靠性高、可操作性强的品种鉴定体系，有益于保障彩色棉产业健康发展。

目前，构建品种DNA 指纹数据库的标记主要是 SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列）和SNP（Single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）[8]。部分主要农作物的DNA 指纹数据库已逐步建立标准和规范[9]，如小麦[10]、水稻[11]、玉米[12]、棉花[13]、大豆[14]、烟草[15]。关于棉花 DNA 指纹图谱构建也开展了大量工作[9,16-17]，许鸿越等[18]依据农艺性状和SSR 分子标记对137 份陆地棉、13 份海岛棉以及27 份亚洲棉等多种纤维色泽的种质资源进行研究，发现3 个栽培种中天然彩色棉种质遗传多样性十分丰富。马轩等[19]利用SSR 分子标记构建18个彩色棉品系DNA 指纹图谱，结果显示，彩色棉具有相对狭窄的遗传背景。尤春源等[1]利用SSR 核心引物对2012 年前新疆审定的新彩棉品种构建DNA 指纹图谱并进行遗传多样性分析，区分全部品种需要18 对特异引物及组合引物。Wang 等[20]认为标记NAU3735 和标记NAU5434 分别与棕色纤维基因位点Lc1和Lc2共分离，2015 年筛选获得2个棕色棉纤维色泽决定QTL （Quantitative trait locus，数量性状位点）位点（命名为qFC15-1 和qFC15-2）[21]。 Wen 等[22]将棕色棉纤维Lc1相关的qBFA07-1 和qBFA07-2 两个基因位点的候选基因分别确定为Gh_A07G2341 和Gh_A07G0100，基于该位点的功能标记将有助于棕色棉的分子检测和分子育种。为进一步完善新疆彩色棉花品种DNA指纹图谱数据库，推动彩棉产业健康发展，本研究利用分子标记技术构建了27 个新彩棉系列品种DNA 指纹图谱，为彩棉分子检测和分子育种提供实用标记和理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料和SSR核心引物

以新疆审定的27 份彩色棉品种的种子为供试材料，由石河子农业科学院、中国彩棉（集团）股份有限公司、新疆农垦科学院棉花研究所、石河子大学棉花所提供，包括新彩棉1 号至8 号，10 号至28号（表1）。 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）所用试剂及电泳试剂均购自广州东盛生物科技有限公司。

1.2 棉花基因组DNA提取及检测

采用改良SDS 法[23]提取各材料的种子基因组DNA。使用ND-1000 和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，将 DNA 稀释至 100～200 mg·L－1。

表1 27 个新疆彩色棉品种信息

表1（续）

1.3 PCR扩增及产物检测

PCR 反应体系（20 μL）包括 10 μmol·L－1正、反向引物各 1 μL，10×Taq buffer （含有 Mg2＋）2.0 μL，2.5 mM dNTPs 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL（5×106U·L－1），模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 12.2 μL。 PCR 反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，50～60 ℃（以引物的Tm 值为依据变换）退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，循环 33 次；72 ℃延伸10 min，扩增产物于4 ℃保存备用。

PCR 扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳―银染法进行检测[9]，上样量为 3～5 μL，在150 V 恒压下电泳110～130 min（根据室内温度和引物扩增片段大小的不同更改）。固定、银染、显色后终止反应[24]，放在凝胶观察灯上拍照统计数据。

1.4 数据整理与分析

依照同一引物在27 个品种基因组DNA 扩增带型依次编号（1―10），统计分子标记SSR 多态性带型和所代表的等位位点个数[25]；根据PCR 扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳的相对迁移位置，对条带分布情况进行数据统计[26]，采用“0、1”计带方法[27]记录，即在凝胶的同一条带上，有带记为1、无带记为0，统计分析数据。

根据每对引物在供试材料中扩增带型及数量的不同，计算分子标记多态性信息含量（Polymorphism information content，PIC）值，PIC=1－∑（Pi）2，其中Pi 指某一标记第i 个扩增带型产生的频率，∑（Pi）2为此标记所有多态性带型的（Pi）2之和[26,28]。利用NTDYS 2.1 软件中的Similarity 模块计算品种间遗传相似系数，采用未加权平均数（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）[9]和主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）[29]分别绘制树状聚类图和二维散点图进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性引物筛选及多态性带型分析

根据实验室前期筛选出的SSR 核心引物和相关文献报道的功能标记[22]，从棉花生物信息学数据库（http://www.cottongen.org/）和棉花功能基因组学数据库（https://cottonfgd.org/）中查找引物序列，由华大基因科技股份有限公司合成，根据亲缘关系远近选取部分新彩系列棉花品种用于引物初步筛选，最终筛选出条带简单、多态性高、稳定性好的52 对多态性引物（表2），对供试材料进行PCR 扩增，构建新疆彩色棉品种指纹图谱。

52 对多态性引物在27 份材料中扩增得到155个扩增带型，平均每对引物2.98 个，变化范围为2～7 个。其中，大于平均值的多态性引物有27 个。其中，SSR225 扩增出 7 种带型，带型数最多（图1），表示该位点变异频率最高，遗传多样性丰富。DPL0111 有 6 种带型，NAU2277、W01、okra-195、DPL0757 和 HAU2786 有 5 种扩增带型。核心引物PIC 值介于 0.137 1～0.776 4 之间（表2），平均值为0.454 3，其中PIC 大于平均数的引物有26 个，平均值达0.557 6，引物编号依次为1―26，表明这些引物鉴别能力较强。扩增带型数和多态性信息含量皆大于平均数的核心引物有18 对，如引物SSR225的PIC 值和多态性带型个数分别为0.776 4 和7（表1 和图1A），进一步证实这些分子标记具备较高的鉴别能力，适合用于新彩棉系列品种鉴定、指纹图谱的构建、纯度真实性检测及遗传多样性分析等相关研究。

表2 52 对核心引物信息

表2 （续）

2.2 新彩系列棉花品种指纹图谱分析

图1 引物SSR225、W01 在27 个彩棉品种中的电泳扩增图

采用52 对多态性引物对27 个新彩棉系列品种进行DNA 指纹图谱分析。根据PCR 扩增产物的电泳条带显示，其中12 个新彩棉品种存在特征引物（表3）。具有特征引物的品种，因其具有明显区别于其他品种特有指纹信息的引物[9]，仅用特征引物即可将该品种与其他26 个新彩棉系列品种区分开。结果显示，新彩棉1 号、新彩棉5 号、新彩棉10号、新彩棉13 号和新彩棉17 号分别具有1 对特征引物，新彩棉7 号、新彩棉16 号、新彩棉27 号和新彩棉28 号分别具有2 对特征引物，新彩棉8 号具有3 对引物，新彩棉4 号具有5 对特征引物，新彩棉22 号具有9 对特征引物。图1A 为分子标记SSR225 在27 个材料中的电泳扩增图，其多态性信息含量PIC 值为0.78，有7 种多态性带型，可以一次性鉴别出新彩棉8 号和新彩棉22 号。图1B 所示是核心引物W01 电泳扩增图，多态性带型有5种，可鉴定出新彩棉8 号和新彩棉27 号。

其他15 份新彩棉材料无特征引物，需要使用多对引物进行鉴别，表4 给出了这15 个品种鉴定所需的最少引物组合。以鉴定新彩棉2 号为例，第一步利用分子标记NAU1167，根据PCR 扩增产物电泳检测带型结果，将新彩棉1 号、新彩棉2 号、新彩棉6 号、新彩棉 15 号、新彩棉 19 号、新彩棉 20 号、新彩棉21 号和新彩棉23 号（这8 个材料带型一样）从27 份材料中区分出来。第二步使用多态性标记JESPR0251 将新彩棉1 号、新彩棉2 号和新彩棉6号鉴别出来。第三步选用SSR 标记DPL0111 可明显将新彩棉2 号与新彩棉1 号、新彩棉6 号区分开，可将新彩棉2 号从27 份材料中鉴别出来。根据表3和表4，将结果汇总为表5，最少选用9 对多态性引物即可完全区分27 份新彩棉系列品种。

2.3 27份彩棉品种的遗传多样性分析

2.3.1聚类分析。利用NTSYS 2.1 软件进行遗传相似性分析，结果表明，27 个新彩棉品种间的遗传相似系数变化范围为0.573 3～0.955 9，平均值为0.764 6，遗传相似系数范围较大，表明新疆彩色棉品种遗传多样性相对丰富。聚类分析（图2）显示，遗传相似系数约为0.611 5 时，可将27 个彩棉系列品种分为 3 类，Ⅰ类包含新彩棉 1、2、6、11、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和 28 号，Ⅱ类包含新彩棉 10、12、16 号，Ⅲ类包含新彩棉 3、4、5、7、8 和 27 号。新彩棉 1 号和 6 号间的遗传相似系数最大，说明两者遗传差异最小；新彩棉7 号和新彩棉20 号间的遗传相似系数最小，说明两者亲缘关系较远。

2.3.2主坐标分析。应用NTSYS 2.1 软件对原始矩阵数据进行PCoA 分析（主坐标分析），利用Eigen 程序绘制主坐标分析图（图3），供试材料聚为3 大类群，二维主坐标分析结果与树状聚类结果有一定差异性和一致性。树状图中Ⅰ类涵盖群A以及群B 的3 个品种，树状图Ⅱ和Ⅲ类聚为群C（缺少新彩棉4 号和10 号）。总体来说，两种聚类结果相似，试验材料具有一定的遗传多样性。

表3 12 个新疆彩色棉品种的特征引物

表4 鉴定另外15 个新疆彩色棉品种的最优引物组合

表5 27 个新疆彩色棉品种的9 对核心引物十进制数字指纹代码

2.4 新彩棉系列品种二维码的构建

利用分子标记技术进行棉花品种鉴定，可以弥补常规品种检测手段的不足，作为田间鉴定的补充。本研究为每个品种构建专属二维码，扫描二维码可以了解该品种的相关信息，二维码生成网址为：http://www.liantu.com/，其中 4 个品种的二维码见图4。

3 讨论

随着人们生活水平的不断提高，绿色、天然、环保、健康已然成为了消费者对纺织品的新追求，彩色棉与纺织品绿色、健康的发展方向完全一致。目前，关于新彩棉系列品种研究主要涉及影响纤维质量和色泽沉着相关基因的功能分析、色泽形成机理及与其他棉种在各项指标对比等方面[30-31]，基于分子标记进行品种鉴定相关研究较少。鉴于棉花种子市场多、乱、杂问题严重，应加强关于天然彩色棉种质鉴别方面的研究。本研究利用分子标记对新彩棉品种进行鉴定，有助于新彩系列品种的分子检测、新品种培育及棉花产业绿色健康可持续发展。

图2 基于遗传相似系数构建的27 份新彩棉系列品种的树状聚类图

图3 27 个新彩棉系列品种的二维主坐标分析图

图4 部分新彩棉品种二维码

本研究使用52 对核心引物在27 份供试材料中共扩增出155 个多态性带型，多态性信息含量大于平均值的26 对引物中，只有4 对与已有研究报道相同[1]，鉴定筛选出的核心引物多态性高，鉴别能力强，可用于彩棉系列品种纯度和真实性检测、遗传多样性分析及分子育种工作。本研究并未选取均匀分布于棉花26 对染色体的多态性引物，而是更多选取与控制农艺性状位点连锁的标记，不仅可用于遗传多样性分析，还可用于目标性状的分子检测。棕色棉基因Lc1的紧密连锁标记SSR225[22]可将其中的6 个绿色棉与20 个棕色棉区分开，将新彩棉4 号（绿色）与其他17 个棕色棉区分，但新彩棉 4 号（绿色）和新彩棉 13 号、20 号、24 号（棕色）不能区分；SSR241 和utr_0143down 均可作为新彩棉4 号的特征引物将其与其他棕色棉品种区分。Gh_A07G0100 为qBFA07-2 基因座的候选基因，可将新彩棉22 号与其他26 个品种区别，但不能区分棕色棉与绿色棉，因为qBFA07-2 基因座作用于棕色纤维颜色深浅，并未控制棕色纤维颜色沉积。

树状图聚类分析显示，除新彩棉5 号和10 号外棕色棉均聚在Ⅰ类，绿色棉和新彩棉5 号、10 号（棕色）分布在Ⅱ和Ⅲ类；二维主坐标分析显示，群A 包含的12 个品种均为棕色棉，群B 聚集4 个棕色棉和1 个绿色棉（新彩棉4 号），群C 包含除新彩棉4 号外的所有绿色棉和1 个棕色棉（新彩棉5号）。主坐标分析与树状图聚类相似，结果与纤维颜色较为一致。总体来看，棕色棉品种相似系数比绿色棉相似系数高，表明绿色棉具有更高的遗传多样性。本研究中新彩棉1 号和6 号聚为一类后与新彩棉2 号聚在一起；尤春源等[1]研究中，新彩棉1 号和2 号先聚为一类，再与新彩棉6 号聚在一起；系谱关系显示新彩棉1 号与2 号同为棕色彩棉BC-B系选所得，新彩棉6 号为新路早6 号与棕2 杂交而来，可能是因为研究选取SSR 位点及类型有所不同，但3 个品种间的遗传相似系数是最高的，揭示了他们之间较近的亲缘关系。新彩棉3 号和4 号聚为一类，系谱信息显示均为绿色彩棉BC-G01 系选，但其相似系数较低，与尤春源等[1]研究结果一致，表明绿色棉同品系间的遗传基础较为广泛。新彩棉16 号是由系9 作为母本杂交育成，新彩棉20号和24 号以系9 为父本杂交育成，聚类分析显示相对于新彩棉16 号，新彩棉20 号和24 号相似系数较高。聚类分析从一定程度上揭示了试验材料间的亲缘关系，但与品种选育系谱信息并不完全契合。利用分子标记技术对现有种质资源进行遗传多样性分析，合理利用现有种质资源，并基于彩色棉纤维性状控制位点连锁标记或功能标记开展彩色棉分子标记辅助育种，提高育种效率，保证品种的真实性和纯度，对天然彩色棉产业实现绿色健康、可持续发展意义深远。