贯筋藤提取物对小鼠迟发型超敏反应的影响

刘威良，姬昱，皮渤淼，苏慧敏，吴白芬，黄艾祥

(云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201)

常规的免疫抑制剂如糖皮质激素、环磷酰胺等化学药物在器官移植阈自身免疫系统疾病治疗方面发挥着重要作用，但这类药物毒副作用大、依赖性强等缺点限制其在临床上的应用[1].研究发现，某些植物提取物是天然的免疫抑制剂且毒副作用弱、无依赖性等优点深受广大科研工作者的青睐.

贯筋藤(DregeasinensisHemsl.var.corrugataTsiang etp.t.)为萝藦科(Asclepiadaceae)南山藤(DregeaE.Mey)属植物苦绳(DregeasinensisHemsl)的一个变种，俗称“奶浆藤”，主产云南大理、丽江、昆明等地，广西、贵州也有分布，生长在海拔500～3 000 m的山地森林或灌木丛中[2-3].贯筋藤浑身是宝，其各个器官用热水蒸煮浸泡后的溶液，可用来制作云南大理一种特色小吃“乳扇”，其鲜叶、花蕾可与辣椒面、豆豉等风味调料一起搭配烹饪食之.贯筋藤的干茎是我国傣族医药(傣百解胶囊)的一味药材，用于治疗痈疮疖肿，风湿弊痛，咳嗽痰喘等病症[4].古代一些医药专著也记载贯筋藤可祛风湿止痛、平喘止咳、通经下乳，用以医治风湿痹痛、肺热咳喘、跌打损伤等病症.现代药理学研究表明贯筋藤富含黄酮、多糖、甾体皂苷及蛋白质等活性成分，具有抗癫痫、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、抗寄生虫及免疫调节等多种生物活性[5-6].

目前关于贯筋藤的研究主要集中在贯筋藤蛋白酶和小分子功能物质方面，如黄艾祥课题组对贯筋藤蛋白酶进行了相关研究[7-8]，中科院昆明植物研究所对贯筋藤中的小分子活性物质进行了分离鉴定[9].关于贯筋藤对体内T细胞介导的免疫应答影响的报道颇少.贯筋藤经水泡提取具有凝乳活性的物质后直接丢掉造成资源的浪费，本文以贯筋藤干茎和经水提凝乳蛋白酶后的料渣作为试验对象，推测其在体内可能发挥免疫抑制作用，建立了二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene，DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity，DTH)模型[10]，探究其醇提物对小鼠迟发型超敏反应的影响并初步探讨了其可能的作用机制，为贯筋藤保健食品及药品开发提科学依据.目前贯筋藤提取物主要作为一种天然凝乳剂应用于食品工业，其提取凝乳活性物质后剩余残渣仍含有较多生物活性成分及营养物质，随着政府部门极力倡导节能减排，作为科研工作者的我们如何高效、合理利用药渣具有重要的现实意义.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 贯筋藤鲜茎采自云南大理州剑川县，海拔2 000～3 000 m山地森林或灌木丛中.

1.1.2 试验动物 SPF级昆明种小鼠，雄性，体质量(18～22 g)，由昆明医科大学实验动物中心提供[SYXK(滇)K2013-0004].

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试剂 醋酸泼尼松(批号：20170518)，浙江仙琚制药股份有限公司；2,4-二硝基氟苯(DNFB)(批号：20170916)；无水乙醇(分析纯，批号：20171025)，天津市风船化工股份有限公司；丙酮(批号：20170801)，天津市风船化工股份有限公司；橄榄油(批号：20180520)，上海化学试剂公司；血清干扰素-γ(IFN-γ)小鼠ELISA试剂盒(批号:20180410)，武汉华联生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠(批号：F20170909)，国药集团化学试剂有限公司.

1.2.2 仪器与设备 400 Y多功能粉碎机(永康市铂殴五金制品有限公司)；Scientz-500 C多功能恒温超声萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；RE520旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)； TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；Thermo1500全波长酶标仪(芬兰雷勃公司)； HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；直径8 mm打孔器(湖北医疗器械一厂).

1.3 方法

1.3.1 样品的制备[7,11]贯筋藤及料渣醇提物：称取1 kg贯筋藤干茎，粉碎，加入70%乙醇，料液比为1∶10，超声提取(功率600 W，25 ℃，工作间歇比2 s/2 s)30 min，用纱布过滤，旋转蒸发仪浓缩至无醇味，真空冷冻干燥备用；称取1 kg贯筋藤干茎，洗涤敲断20倍水浸泡(60 ℃，30 min)提酶后得料渣，放烘箱50 ℃烘干后同法制备料渣醇提物.以上所得醇提物均浓缩至相当于原生药量1 g/mL的药液，临用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成悬浮液.

1.3.2 小鼠DTH模型的建立[12-13]试验第1天(诱导期)，将各组小鼠腹部固定部位用剃须刀剪短，然后用脱毛膏去毛，面积为3 cm×3 cm，局部均匀涂抹1% DNFB的丙酮-橄榄油溶液(1∶1)100 μL，空白组涂抹等量的不含DNFB的丙酮-橄榄油溶液.第2天同样方法致敏1次，第6天(激发期)将1%DNFB的丙酮-橄榄油溶液(1∶1)20 μL，均匀涂于小鼠右耳廓进行激发，左耳涂等量的丙酮-橄榄油溶液(1∶1)作对照，空白组左右耳涂抹等量的不含DNFB的丙酮-橄榄油溶液.

1.3.3 小鼠免疫抑制模型的建立 参考文献方法并改进，采用醋酸泼尼松(10 mg/kg)连续灌胃给药，致使小鼠免疫器官(胸腺和脾脏)萎缩，建立小鼠免疫抑制模型.连续给药数天后，计算胸腺、脾脏指数，与空白组比较，经泼尼松处理组小鼠免疫器官指数有明显降低趋势且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，此时表明造模成功[14].

1.3.4 动物分组及处理 按照《中药新药临床研究指导原则》剂量选择的方法，将人用剂量折算成小鼠给药剂量，将84只小鼠按体质量随机分成7组，确保组间体质量无显著性差异(P>0.05)，每组12只，即空白组、DTH模型组、泼尼松组、贯筋藤醇提物组、贯筋藤料渣醇提物组、贯筋藤醇提物+泼尼松组、贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组.各组均灌胃给药，给药组给予相应药物(生药量)2 g/kg，醋酸泼尼松10 mg/kg，空白和模型组给予同等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液.自致敏前1 d开始，连续给药6 d，至末次给药后30 min，开始激发，24 h后摘眼球取血后脱颈椎处死小鼠，剪下两耳，同时取胸腺和脾脏；小鼠眼球取血后离心取上清，按照IFN- ELISA试剂盒说明书进行含量检测.为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.5 耳廓肿胀度的检测 将各组小鼠左右耳廓用直径8 mm打孔器同部位等面积切下耳片，称质量，计算肿胀度[15]：

耳廓肿胀度(mg)=右耳质量(mg)-左耳质量(mg)

耳廓肿胀抑制率(%)=

为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.3.6 脏器指数的测定 将各组小鼠剖下的脾脏和胸腺用生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，称质量并计算[16-17]：

为减小系统误差，所有试验均采用平行操作.

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠耳肿胀度的影响

本研究表明，与空白组比较，DTH模型、泼尼松、贯筋藤醇提物、贯筋藤料渣醇提物、贯筋藤醇提物+泼尼松及贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组小鼠耳廓肿胀度有明显升高趋势且有统计学差异(P<0.01)，同时亦说明小鼠迟发型超敏反应模型复制成功；与DTH模型组比较，泼尼松组和正常免疫组小鼠耳廓肿胀度明显抑制(P<0.05或P<0.01)，贯筋藤醇提物+泼尼松及贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组小鼠的耳廓肿胀度亦明显减轻且有统计学差异(P<0.01)；与泼尼松组比较，免疫抑制组小鼠耳廓肿胀度有明显减轻的作用趋势，但无统计学差异(P>0.05).由上述可知贯筋藤提取物对正常免疫小鼠有一定的免疫抑制作用，免疫抑制小鼠经贯筋藤提取物干预后，耳廓肿胀度得到有效缓解，但相比空白还是有所差异，表明其与阳性药醋酸泼尼松有一定的协同作用，结果见表1.

2.2 贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠免疫器官质量的影响

本研究显示，与空白组比较，DTH模型组小鼠胸腺和脾脏指数无显著性变化(P>0.05)，泼尼松、贯筋藤醇提物+泼尼松及贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组小鼠胸腺和脾脏指数显著降低且有统计学差异(P<0.01)，同时亦说明小鼠免疫抑制模型建立成功；与DTH模型组比较，泼尼松、贯筋藤醇提物+泼尼松及贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组小鼠胸腺和脾脏指数明显降低(P<0.01)，正常免疫小鼠无显著性变化(P>0.05)；与泼尼松组比较，免疫抑制小鼠胸腺和脾脏指数无显著性差异(P>0.05).由此可知小鼠胸腺和脾脏指数的降低主要是由于泼尼松引起的，同时亦表明小鼠免疫抑制模型复制成功，经贯筋藤提取物干预后小鼠胸腺和脾脏指数未发生差异性变化，其发挥免疫抑制作用机理与醋酸泼尼松有所不同，有待进一步考察，结果见表2.

与空白组比较，aP<0.05，AP<0.01；与DTH模型组比较，bP<0.05，BP<0.01

Compared with control group “a”indicate the significant differences(P<0.05)，“A”indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with DTH model group“b” indicate the significant differences(P<0.05)，“B” indicate the significant differences(P<0.01).

组别Group数量/只Number剂量/kgDose胸腺指数/(mg·g-1)Thymus index(脾脏指数/(mg·g-1)Spleen index空白 Control1220 mL44.01±9.3146.10±6.59DTH模型 DTH Model 1220 mL44.88±7.6754.14±14.92泼尼松 Prednisonel1210 mg15.94±5.04AB29.38±6.04AB贯筋藤醇提物Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl122 g39.83±6.0956.43±9.55贯筋藤料渣醇提物Ethanol extrat of residue of Dregea sinensis Hemsl122 g44.00±7.1455.34±5.79贯筋藤醇提物+泼尼松Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg10.19±3.89BA24.52±6.37BA贯筋藤料渣醇提物+泼尼松Ethanol extrat of residue of Dregea sinensisHemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg15.58±12.53BA27.02±4.41BA

与空白组比较，aP<0.05，AP<0.01；与DTH模型组比较，bP<0.05，BP<0.01.

Compared with control group “a”indicate the significant differences(P<0.05)，“A”indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with DTH model group“b” indicate the significant differences(P<0.05)，“B” indicate the significant differences(P<0.01).

2.3 贯筋藤提取物对迟发型超敏反应模型小鼠血清IFN-γ的影响

本研究表明，与空白组比较，DTH模型组小鼠血清IFN-γ含量明显升高(P<0.05)；与DTH模型组相比，泼尼松、贯筋藤醇提物+泼尼松及贯筋藤料渣醇提物+泼尼松组小鼠血清IFN-γ显著降低且有统计学差异(P<0.05)，正常免疫小鼠血清IFN-γ明显降低(P<0.05)；与泼尼松组比较，免疫抑制小鼠呈现降低趋势，但没有统计学意义(P>0.05).由此可知，贯筋藤提取物发挥免疫抑制作用的机理可能与通过降低细胞炎性因子血清IFN-γ含量有关，免疫抑制组小鼠经贯筋藤干预后，与泼尼松组比较，血清IFN-γ含量呈现降低趋势，表现出一定的协同作用，结果见表3.

组别Group数量/只Number剂量/kgDoseIFN-γ/(μg·mL-1)Interleukin gamma空白 Control1220 mL161.94±14.67bDTH模型 DTH Model1220 mL179.39±16.03a泼尼松 Prednisonel1210 mg162.02±11.2b贯筋藤醇提物 Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl122 g156.31±33.26b贯筋藤料渣醇提物Ethanol extrat of residue of Dregea sinensis Hemsl122 g149.81±35.88b贯筋藤醇提物+泼尼松Ethanol extrat of Dregea sinensis Hemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg160.04±29.46b贯筋藤料渣醇提物+泼尼松Ethanol extrat of residue of Dregea sinensis Hemsl combine with Prednisonel)122 g+10 mg153.95±30.22b

与空白组比较，aP<0.05，AP<0.01；与DTH模型组比较，bP<0.05，BP<0.01.

Compared with control group “a”indicate the significant differences(P<0.05)，“A”indicate the significant differences(P<0.01)；Compared with DTH model group“b” indicate the significant differences(P<0.05)，“B” indicate the significant differences(P<0.01).

3 讨论

DTH是由特异性致敏T细胞介导的细胞免疫反应，T细胞在自身免疫、肿瘤免疫、移植物排斥反应等方面起着重要作[18].DNFB是一种半抗原，将其稀释液涂抹于腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T细胞增殖活化为致敏T细胞，经过抗原提呈细胞作用效应T细胞后，释放一些细胞因子如IFN-γ、IL-2等，产生炎性细胞浸润为主的细胞免疫损伤效应[19].研究表明，DNFB诱导的DTH模型是一种免疫性模型，对T细胞在炎症免疫性疾病的研究中有一定指导意义.研究发现[20]，环磷酰胺和醋酸泼尼松这2种化学药物均可用小鼠免疫抑制模型的建立，在所建立的免疫抑制模型中，各指标对两种药物的敏感性有所差异，前者对免疫系统的影响较为复杂，并非单纯的抑制作用，试验结果更依赖于检测时限和给药剂量的选择.有学者还指出[21]，醋酸泼尼松、地塞米松等糖皮质类激素药物与环磷酰胺相比，前者偏向于抑制细胞免疫，后者利于体液免疫抑制模型的建立.考虑试验免疫模型的建立应根据需要选择合适的造模剂，醋酸泼尼松成本相对较低、免疫抑制模型建立操作简便，本研究采用醋酸泼尼松连续灌胃小鼠复制小鼠免疫抑制模型，通过计算胸腺、脾脏指数，与空白组相比，泼尼松组小鼠胸腺、脾脏指数显著降低且有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，则认为模型建立成功.

本研究以DNFB诱导迟发型超敏反应，采用醋酸泼尼松连续灌胃小鼠建立免疫抑制模型，由试验数据可知，与空白比较，泼尼松组小鼠胸腺和脾脏指数显著减低，且有统计学差异(P<0.01)，DTH模型组小鼠耳廓肿胀度明显升高，且有显著性差异(P<0.01)，表明小鼠免疫抑制模型与DTH模型复制成功.在动物模型建立成功的基础上，初步探讨贯筋藤提取物对DTH的影响及作用机制，试验结果显示，贯筋藤提取物使正常免疫小鼠的耳廓肿胀度明显减轻(P<0.01)，醋酸泼尼松抑制了小鼠的细胞免疫功能，致使DNFB很难诱发出小鼠耳廓的肿胀，经贯筋藤提取物干预后，各组小鼠耳廓肿胀度有减轻趋势，表明它具有协同免疫抑制剂的作用.

在机体中，胸腺是重要的中枢免疫器官，是T细胞分化、发育的场所，主要参与细胞免疫；脾脏是产生致敏淋巴细胞和抗体的场所，其中大量的T淋巴细胞、B细胞在机体防御和清除功能中发挥重要作用[22-23].因此胸腺和脾脏指数是2个衡量模型动物体内免疫水平的关键指标.研究表明，醋酸泼尼可通过使脾脏和胸腺出现不同程度的萎缩达到细胞免疫抑制作用[24]，本研究中贯筋藤提取物对各组小鼠的胸腺和脾脏指数作用不明显，则其发挥细胞免疫抑制作用的机制与泼尼松不同.另外，T细胞中的Th1亚群细胞主要介导细胞免疫是DTH的效应细胞，在增强炎症反应中起重要作用，IFN-γ是Th1细胞分泌的细胞因子可调节T细胞增殖和免疫性、提升有效的DTH反应等方面[25].本试验结果显示，贯筋藤提取物可明显降低正常免疫小鼠血清IFN-γ的水平(P<0.05)，可能是其抑制DTH反应的作用机制.考虑给药剂量对免疫的调节作用具有双向性，试验有待进一步研究.

贯筋藤作为一种药食同源植物，其醇提物对小鼠细胞免疫主要形式之一的DTH反应有一定的抑制作用，其机制可能与抑制DTH中Th1细胞IFN-γ的分泌水平有关，其发挥药效的物质基础可能是其中一些小分物质如黄酮、生物碱等，具体是哪类单体化合物起作用，有待进一步考察.研究表明[26]，一些西药类免疫抑制剂在发挥治疗作用的同时也对肝脏、肾脏及神经系统造成不同程度的损伤，然而一些植物提取物具有活性高、毒副作用小等优点，其开发利用日益受到广大学者青睐，可以推测其在体内免疫抑制剂的应用上有更值得深入研究的价值.

4 结论

综述所述，本研究主要初步考察了贯筋藤粗提物对小鼠DTH反应的影响(特异性免疫指标)，结果发现，适宜浓度的贯筋藤提取物对正常免疫小鼠及免疫抑制小鼠均有一定的刺激作用，显著降低DTH模型组小鼠耳廓肿胀度及血清IFN-γ的水平，发挥一定的免疫抑制作用且能与泼尼松有协同效果，但对中枢免疫器官(胸腺与脾脏)影响未见差异性变化，这表明其作用机制与泼尼松有所不同，具体作用机制有待进一步考察.总之，试验研究可为以后保健食品及药品的研发提供数据支撑，也为贯筋藤料渣资源高效利用提供新的途径.