基于增感屏的辐射光成像的基本性能研究

李桂玉，康 飞，汪 静，卢虹冰*

（1.空军军医大学军事生物医学工程学系，西安710032；2.空军军医大学第一附属医院核医学科，西安710032）

0 引言

切伦科夫光成像（Cerenkov luminescence imaging，CLI）是基于切伦科夫辐射的光学成像技术，满足切伦科夫辐射发生条件的放射性核素在衰变时会发出切伦科夫荧光，因而可通过探测发出的光信号实现对放射性核素标记的示踪剂的可视化观察。2009年CLI 被首次用于活体成像[1]，然后被迅速用于肿瘤组织探测[2]、手术导航[3]、肿瘤微环境[4]以及放射治疗剂量学[5]等方面的研究。其最具潜力的临床应用有甲状腺显像[6]、淋巴显像[7]及内窥镜检查[8]。

然而，CLI 的内在特性大大阻碍着其临床转化的进程。一是切伦科夫光信号的蓝光光谱特性导致其组织穿透性差[9]。二是光信号强度极其微弱，与标准荧光成像相比要弱几个数量级[10]。为了增强切伦科夫光信号的穿透性和信号强度，研究者提出了基于二次荧光激发的策略[11-12]，通过将切伦科夫荧光源（放射性示踪剂）与荧光材料混合（如图1 所示），将切伦科夫光能量或放射性能量转化为近红外光信号。尽管这种策略可使切伦科夫荧光信号的强度和穿透力提高2～3 倍，但其临床转化仍然面临着挑战。首先，转化而来的近红外光信号仍然需要穿过生物组织才能被检测到，信号损失依然没有解决。其次，荧光材料的引入增加了关于生物安全和化学结构复杂性的担忧。再次，如何在局部的生物分布中实现荧光材料在靶组织的聚集具有挑战性。

增感屏是一种含有高效辐射发光材料的X射线平片成像设备附件。研究表明，在β、X 和γ 射线的激发下，增感屏可以发射出强烈的光信号[13]。因此，本文设计将增感屏放置在生物组织表面（如图2 所示），提出一种改进的基于增感屏的辐射光成像（radioluminescence intensified screen imaging，RLISI）技术，利用穿透生物组织的射线在组织表面激励增感屏，形成辐射光信号。此技术一方面可避免光信号在组织内传输造成的误判；另一方面，增感屏置于体表，无需担心生物分布或生物安全性的问题，对辐射荧光材料的选择范围更大。本文对RLISI 策略进行可行性研究，并与CLI 进行体外和体内实验对比。

图1 CLI 增强策略

图2 RLISI 成像策略

1 材料与方法

1.1 CLI 及RLISI 成 像系统

由图1、2 可知，2种成像的光学信号均由荧光成像系统检测，该系统由一个电子倍增CCD（electron-multiplying chargecoupled device，EMCCD）相机（型号iXon3 888，安道尔科技公司）、一个标准定焦镜头（施耐德镜头F/0.95）以及一个避光箱组成，与广泛使用的小动物活体光学成像系统（型号IVIS LuminaⅡ）相似。RLISI 成像中的增感屏选用临床上最为常用的钨酸钙中速增感屏[玉环牌，8 in×10 in（1 in=25.4 mm），中国浙江玉环医疗器械公司]。

RLISI 与CLI 的采集参数相同，电子增益为1000，binning 值为1，曝光时间为10 s。对Eppendorf 管管帽内放射性核素直接进行光学成像，即CLI；在管帽上覆盖增感屏后对增感屏进行光学成像，即RLISI。

在每次成像前，采集5 幅背景图像以计算平均背景噪声强度，并从采集图像中剔除背景噪声信号。由于核素衰变产生的小部分高能射线可以穿透增感屏抵达相机，从而形成脉冲噪声，为进一步改善图像质量，本研究采用中值滤波法滤除该噪声。所有采集图像以伪彩呈现，并与相应的白光图像进行叠加。上述图像处理均通过MATLAB R2015b 软件编程实现。

1.2 材料

为比较不同放射示踪剂的成像效果，实验共选用3 种放射示踪剂。其中，高99m 锝酸钠（Na99mTcO4，以下简称“99mTc”）由钼锝发生器（北京原子高科公司）淋洗获得，是临床单光子成像中最常用的放射性示踪剂，为γ 衰变，能峰为140 keV；氟[18F]-脱氧葡萄糖（18F-FDG，以下简称“18F”）由回旋加速器（HM-10型，日本住友公司）生产，是临床正电子成像中最常用的放射性示踪剂，为β+衰变，能峰为511 keV；32磷酸钠（Na332PO4，以下简称“32P”）溶液购自北京原子高科公司，是临床常用的治疗性核素，为β 衰变，发出纯β 射线，射线平均能量为0.69 MeV。

1.3 体外实验

1.3.1 RLISI 的基本特性

将体积为60 μl、放射性活度均为0.37 MBq（10 μCi）的18F、99mTc 以及32P 溶液分别加入到3 个规格均为1.5 ml 的Eppendorf 管管帽中。由于切伦科夫光信号可以被一张黑色纸张屏蔽，为了评判切伦科夫光信号是否可能穿透增感屏从而影响RLISI 的成像结果，在CLI 和RLISI 组之外增加黑纸屏蔽组，即将黑色纸张插入增感屏与管帽之间然后进行RLISI。

为了研究RLISI 的光谱特性，将99mTc 作为激励源，采用荧光分光光度计（型号F7000，日本日立公司）测量其光谱分布。99mTc 不会产生切伦科夫光信号，测量时其辐射光谱不会受到切伦科夫光信号的干扰。

1.3.2 与核素显像结果的定量相关性

制作体积均为60 μl，放射性活度分别为0、0.37、0.74、1.11、1.48 MBq（即0、10、20、30、40 μCi）的18F 和99mTc 溶液，然后将溶液加入到Eppendorf 管管帽中。采用与之前相同的显像参数对2 组管帽进行CLI 和RLISI。使用小动物PET/CT（型号Nano PET/CT，匈牙利Mediso 公司生产）对18F 组进行PET 成像。使用临床SPECT/CT（型号NM/CT Discovery 670，GE 公司生产）对99mTc 组进行ECT 成像。通过勾画感兴趣区域（region of interest，ROI），测量每个管帽中PET 图像的放射性浓度或ECT 图像的总计数，研究CLI 和RLISI的信号强度与核素成像定量结果之间的相关性。

1.3.3 灵敏度

通过研究RLISI 和CLI 的灵敏度进一步评估这2种技术之间的性能差异。将体积均为60 μl，放射性活度分别为37、3.7、0.37、0.037 kBq（即1、0.1、0.01、0.001 μCi）的18F 和99mTc 溶液加入到Eppendorf 管管帽中。为了更好地确定灵敏度的阈值，光学成像系统的参数调整为电子增益=1 000，binning 值=4，曝光时间=60 s。采集18F 的CLI 图像和RLISI 图像以及99mTc的RLISI 图像。

1.3.4 穿透性

在一个Eppendorf 管管帽中加入体积为60 μl、放射性活度为0.37 MBq（10 μCi）的18F 溶液，在管帽上覆盖厚度为10 mm 的猪肉组织，然后分别进行CLI和RLISI，去掉猪肉组织但保持相机与管帽（或增感屏）之间的距离为10 mm，再次进行CLI 和RLISI。CLI成像参数：电子增益=1 000，binning 值=4，曝光时间=60 s。RLISI 成像参数：电子增益=1000，binning 值=1，曝光时间=10 s。延长CLI 采集时间是为了更准确地判断表面覆盖生物组织情况下是否还可以观察到CLI 信号，理论上这种情况下CLI 信号很微弱。由于CLI 的曝光时间和binning 值比RLISI 大，采用下面的公式以得到相同单位表示的CLI 和RLISI 光信号强度：

其中，ICLI为CLI 实际获得的光信号强度；TRLISI和TCLI为RLISI 和CLI 的曝光时间；BV 为CLI 的binning值。在本研究中，TRLISI=10 s，TCLI=60 s，BV=4。

1.3.5 空间分辨力

采用放射性活度为0.37 MBq（10 μCi）的18F 溶液作为信号激励源，RLISI 成像参数：电子增益=1 000，binning 值=1，曝光时间=10 s，增感屏与源之间的距离依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0 cm，依次进行RLISI。分辨力是通过计算所得图像中光斑的半高全宽（full width at half maxima，FWHM）得到的。此外，在成像之前使用标尺确定图像上的像素和实际长度之间的关系，得到25 个像素宽度为1 mm。

1.4 体内实验

本研究中动物护理和使用协议已获空军军医大学动物伦理审查研究委员会（协议号090260）批准。所有动物实验均遵照动物伦理审查委员会指南的要求进行。

1.4.1 荷瘤小鼠肿瘤显像

为了测试RLISI 的实际性能，在活体上进行CLI和RLISI 2种成像技术的对比，利用18F 核素进行基于RLISI 的HT-1080 腹部移植瘤小鼠显像。对荷瘤小鼠尾静脉注射体积为100 μl、放射性活度为14.8 MBq的18F 显像剂，1 h 后行小动物PET 显像和CLI，在肿瘤组织表面覆盖增感屏后进行RLISI。因为CLI 信号低，所以设置CLI 成像参数为电子增益=1 000，binning 值=4，曝光时间=120 s。RLISI 成像参数不变（电子增益=1 000，binning 值=1，曝光时间=10 s）。CLI 结果展示的是CLI 图像与白光图像的融合图像，而RLISI 结果展示的是由RLISI 图像与去掉增感屏的白光图像的融合图像。

1.4.2 兔子腘窝淋巴造影

为了检测单光子RLISI 的实际性能，使用99mTc-葡聚糖（99mTc-DX）对3 只兔子进行基于RLISI 的淋巴造影。在每只兔子的右脚处注射放射性活度为37 MBq（1 mCi）的99mTc-DX 溶液，注射后15 min 进行SPECT/CT 融合断层成像。在由SPECT/CT 图像所显示的阳性皮下腘窝淋巴结的部位放置增感屏进行RLISI。对该淋巴结进行手术切除，对切除前暴露状态下的淋巴结和切除后的淋巴结组织分别进行RLISI，成像参数为电子增益=1 000，binning 值=4，曝光时间=10 s。最终的RLISI 图像是兔子的RLISI 图像与去掉增感屏的白光图像的融合图像。整个实验过程中均对兔子进行了麻醉处理。

1.5 统计分析

所有数据采用GraphPad Prism 5 软件进行分析，通过t检验方法判定2 组数据差异，多重比较采用单因素方差分析和Bonferroni 校正，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验

2.1.1 RLISI 的基本特性

如图3（a）所示，增感屏可以被18F、32P 和99mTc 3种核素所激励而产生光信号，18F 和32P 可以产生切伦科夫光信号，而99mTc 无法产生切伦科夫光信号（除非特别申明，本文所述光学信号强度均采用任意单位）。图3（b）所示的信号强度定量分析表明，在相同的成像条件下18F 的RLISI 信号要明显高于CLI 信号[（4 478±81.98）vs（294±12.67），P<0.000 1]，平均值为后者的15.23 倍，对于32P[17 459±392.98）vs（968±79.54），P<0.000 1]，其平均值为CLI 的18.04 倍。对于相同放射性活度的不同核素，其RLISI 信号表现出明显差异（P<0.000 1）。

如图3（b）所示，增感屏既可被来自99mTc 的纯γ射线所激发，也可以被来自32P 的纯β 射线所激发。黑纸屏蔽试验中，18F 及32P 的RLISI 信号强度均未受到明显影响[（4 478±81.98）vs（4 443±43.72），P=0.760 4；（17 459±392.98）vs（16 997±137.28），P=0.114]，表明切伦科夫光信号无法激发增感屏。

由99mTc 发出的γ 射线激发产生的RLISI 光谱如图3（c）所示，表明在480、550、580 nm 处有3 个峰，其占比分别为67.2%（550 nm）、24.6%（490 nm）、8.2%（580 nm）。

图3 RLISI 的基本特性

2.1.2 与核素显像结果的定量相关性

图4（a）给出了CLI 和RLISI 的光信号强度与18F和99mTc 放射性活度的关系。定量分析显示，CLI 和RLISI 的信号强度与核素放射性活度之间呈线性相关[r2＞0.99，如图4（b）所示]，与相应核素图像的计数信号之间也呈线性相关[r2＞0.98，如图4（c）所示]，表明RLISI 信号可有效表征核素的放射性活度。18F 的RLISI 信号强度在所研究的放射性活度范围内比其CLI 信号要高出14.27～14.91 倍。

2.1.3 CLI 和RLISI 灵敏度的对比

图4 RLISI 定量相关性分析

如图5（a）所示，18F 的CLI 在活度低于1 μCi 时难以探测到光信号，然而99mTc 和18F 的RLISI 在活度小于0.001 μCi 时光信号强度没有明显下降。为了定量分析所得结果，本研究采用信背比（signal-backgroud ratio，SBR）即ROI 内的信号强度与背景信号强度之间的比值来评价灵敏度差异。如图5（b）所示，选取SBR=1 作为阈值时，在本研究的成像系统中18F的CLI 灵敏度为0.1～1 μCi，而99mTc 和18F 的RLISI 灵敏度为0.001～0.01 μCi，比CLI 的灵敏度高了2 个数量级。即便选取SBR=2 作为阈值，18F 的RLISI 灵敏度也比其CLI 要高出1 个数量级。

2.1.4 CLI 和RLISI 的组织穿透性对比

如图6（a）、（b）所示，CLI 在覆盖了厚度为10 mm猪肉组织的情况下信号强度显著下降[（377.7±8.45）vs（159.7±5.55），P<0.000 1]，而RLISI 的信号强度并没有受到明显影响（[2 293±12.60）vs（2 231±29.74），P=0.128 8]。

图5 CLI 与RLISI 的灵敏度对比

2.1.5 RLISI 的图像分辨力

如图6（c）、（d）所示，随着核素点源与增感屏之间距离的增加，光斑也逐渐扩大。定量分析结果显示FWHM 和点源与增感屏之间的距离遵从良好的二次拟合公式y=8.124x2+9.786x+3.335（r2=0.991 2）。因为FWHM 与图像分辨力呈负相关，以上结果揭示RLISI 分辨力随着点源与增感屏之间距离的增加而降低，其规律与二次函数相符。

图6 RLISI 的穿透性与图像分辨力

2.2 体内实验

如图7（a）所示，PET 显像证实了呈高代谢的肿瘤组织在CLI 和RLISI 中也清楚观察到其光信号。值得注意的是，CLI 的显像条件中binning 值比RLISI的高16 倍，曝光时间比RLISI 的高12 倍。在图7（b）中，定量分析表明RLISI 光子产生率显著高于CLI[（2 355±357.4）vs（193±44.06），P=0.003 9<0.01]，平均值高出12.2 倍。

如图7（c）所示，99mTc 无法产生CLI 信号，而RLISI 很明显地在与SPE CT/CT 显像中一致的部位（腘窝淋巴结）观察到了光信号。如图7（d）所示，剥离皮肤后利用RLISI 显示出了一个边界清晰的腘窝淋巴结，这样就能够识别并外科切除整个淋巴结。此外，RLISI 的过程可近似认为是实时成像，因为曝光时间仅为10 s。

3 讨论

CLI 的低信号与低组织穿透性被认为是阻碍其临床应用的瓶颈[14]。Robertson 等[1]的研究表明CLI 的灵敏度仅仅是PET 成像的10%。事实上，CLI 信号很难穿透一张纸[15]。为了克服这些缺点，研究人员提出了将切伦科夫光能转化为近红外发光量子点的光谱转换策略[16]。同时，其他研究人员先后介绍了另外一种将放射性能量转化为辐射光显像的策略[10]以及利用纳米材料将放射性同位素发出的切伦科夫辐射转化成另一个辐射荧光的策略[17]。

表面辐射光成像并不是在本文研究中首次提出的。事实上近年的报道中已有使用闪烁体的β 辐射光成像（β-RLI）可对小动物[18]和切除的肿瘤组织进行显像[19]。但正电子发射的β 粒子射程很短，这就使得β-RLI 只适用于裸露组织的表面成像。另外，其他研究者也报道了利用放射性同位素发出的γ 射线（18F、131I 和99mTc）激励闪烁晶体[20]或液体闪烁体[21]从而对小动物进行表面辐射光成像的方法。与CLI 这种原位激发策略相比，表面γ-RLI 策略可以以最小的能量损失穿透组织，并且不用进行生物安全性的考虑。

图7 基于RLISI 的小动物活体成像

在本研究中，通过采用低成本、更柔软、商业化的增感屏对γ-RLI 策略进行了简化，并对其临床应用进行了探索。RLISI 的成像系统构成虽与γ 相机有一定的相似性，但在性价比、灵活性与可移植性方面具有独特的优势。对于γ 相机而言，通常一帧图像需要花费数分钟采集足够的计数，而RLISI 近似实时图像，这就意味着RLISI 可以像荧光成像一样用于临床实践中的实时成像，如术中指导和检查。另外，相比于荧光成像，RLISI 在组织穿透性方面具有很大优势，这种优势可以克服荧光成像在深层组织的检测缺陷，如在乳腺癌手术中深部前哨淋巴结的探测或位于深肌层的胃肠道肿瘤的探测。

对于RLISI，目前应用中的一个瓶颈就是射线的散射造成的图像分辨力不佳，特别是深层目标组织，难以获得细节清晰的成像。在后续的研究中，可通过借鉴γ 相机的设计经验，采用准直器或增加散射栅等方式减少散射射线，从而改善图像分辨力，提高成像质量。

4 结语

在本研究中采用临床放射性核素发出的β 射线或γ 射线，构建和实现了RLISI 成像，并进行了CLI和RLISI 的体外和体内对比研究。主要有2 点发现：（1）RLISI 信号强度是CLI 的15 倍以上，灵敏度高出2 个数量级，并且具有良好的生物组织穿透性；（2）利用临床18F 和99mTc 标记的放射性示踪剂，RLISI 可以实现对生物靶组织（小鼠肿瘤、兔子淋巴结）的快速可视化观测，预示了其临床转化的潜能。