沉默热休克蛋白27基因对头颈部鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

朱震坤 王羽裳 徐欣

山东大学口腔医学院·口腔医院种植科 山东省口腔组织再生重点实验室 山东省口腔生物材料与组织再生工程实验室，济南 250012

热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一种在进化过程中存在着高度保守性的分子伴侣家族，能够阻止肿瘤细胞凋亡，且与其转移有密切关系[1]。Hsp27是小热休克蛋白家族的重要一员，在细胞受到不良刺激时产生，以保护细胞免受环境中自由基、热、缺血和毒性物质等各种应激因素导致的损伤，已被证实在细胞分子信号通路的调节，细胞生长、分化和恶化等方面起着重要作用[2-4]。近年来，有报道[5-9]显示Hsp27与多种肿瘤的发生和转移有关。在课题组前期研究[10]中，成功建立了头颈部鳞状细胞癌转移模型，发现头颈部鳞状细胞癌Hsp27随其转移潜能的增加，表达丰度升高。为了进一步研究证实Hsp27在头颈部鳞状细胞癌转移中的作用，本研究构建Hsp27短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体，转染高转移潜能头颈部鳞状细胞癌细胞UM-SCC-22B，观察长效沉默Hsp27后其转移生物学行为的改变。

1 材料和方法

1.1 材料

Hsp27 shRNA慢病毒载体质粒pLKO.1（Open Biosystem公司，美国）；pLKO.1空白对照质粒为美国密歇根大学载体中心自行构建并鉴定；病毒颗粒pLenti-shRNA-Hsp27/pLenti-shRNA-ctrl由密歇根大学载体中心包装生产。

细胞系UM-SCC-22B为美国密歇根大学肿瘤中心Thomas.E.Carey实验室保存头颈部鳞状细胞癌高转移潜能细胞系，是下咽部原位鳞状细胞癌同期淋巴转移灶细胞；所有细胞均于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内常规孵育。

改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、双抗（青霉素100 μg·mL-1，链霉素100 μg·mL-1）（GIBCO公司，美国）；Trizol试剂（Invitrogen公司，美国），RNA逆转录试剂盒、引物合成及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（Applied Biosystems公司，美国），抗Hsp27/β肌动蛋白单克隆抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），二抗（Santa Cruz Biotechnology公司，美国），CellTiter 96®AQueous非放射性细胞增殖检测（简称MTS细胞增殖实验）试剂盒（Sigma公司，美国），Matrigel细胞侵袭小室（BD BioSciences公司，美国），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质浓度测定试剂盒（Thermo Scientific公司，美国）。

1.2 体外转染慢病毒颗粒

1）实验分组：空白对照使用常规培养的UMSCC-22B细胞，记为ctrl组；阴性对照使用UM-SCC-22B细胞转染pLenti-shRNA-ctrl慢病毒颗粒，记为shctrl组；UM-SCC-22B细胞转染pLenti-shRNA-Hsp27慢病毒颗粒作为shRNA慢病毒转染的实验组，记为shHsp27组。

2）慢病毒转染方法：将对数生长期的UM-SCC-22B细胞接种于100 mm培养皿中，全营养细胞培养基培养24 h，40%～60%融合时转导。shHsp27组/shctrl组中分别加入由1 mL 10倍浓度pLenti-shRNA-Hsp27/pLenti-shRNA-ctrl+5mL全营养细胞培养基+6 μL聚凝胺（8 μg·mL-1）配制的慢病毒转染体系。

3）各组细胞37 ℃、5%CO2培养6 h后，更换新鲜全营养培养基，每天换液，24 h后提取总RNA，RT-qPCR检测Hsp27 mRNA表达，72 h后传代。

1.3 RT-qPCR检测体外转染慢病毒颗粒后Hsp27 mRNA 的表达

Trizol试剂分别提取各组细胞总RNA，溶于无RNA酶水中，紫外分光光度计测定OD260/OD280在1.8～2.0之间。取1 μg总RNA逆转录合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），进行RT-qPCR反应。Hsp27引物序列如下：上游，5’-GTCCCTGGATGTCAACCACT-3’；下游，5’-CTTTACTTGGCGGCAGTCTC-3’。β肌动蛋白引物序列为：上游，5’- GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’；下游：5’-CAAAACAATGCTCTGGGTCATCTTCT-3’。RT-qPCR反应程序：50 ℃ 2 min；94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。反应结束依据ΔΔCt法计算相对基因表达量。

1.4 蛋白质印迹检测体外转染慢病毒颗粒后Hsp27蛋 白表达

用蛋白抽提试剂盒分别提取各组总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白半干转膜，5%脱脂牛奶封闭20 min，一抗Hsp27/β肌动蛋白单克隆抗体4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3次，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，增强化学发光（enhanced che miluminescence，ECL）法显影。

1.5 MTS细胞增殖实验

MTS细胞增殖实验检测各组细胞培养24、48 h后细胞增殖的变化。将对数生长期的各组细胞接种于96孔板中，全营养DMEM，37 ℃，5%CO2培养24、48 h，按照100∶1比例，避光加入MTS/PMS混合试剂每孔25 μL，37 ℃、5%CO2培养2.5 h，BioRad550酶标比色仪检测490 nm处的吸光度，每组设3个复孔，取平均值。

1.6 Matrigel体外细胞侵袭实验

检测各组细胞培养40 h后细胞体外侵袭能力的变化。使用无血清1%双抗DMEM细胞悬液将各组细胞接种于自带凝胶化Matrigel基质的上室，下室加入全营养DMEM细胞培养液，37 ℃、5%CO2培养40 h后，抹去上室PET膜上表面细胞及Matrigel凝胶后，置于4 ℃冷室，用-20 ℃保存的甲醇固定10 min，吸弃固定液后，室温下0.5%结晶紫染色，双蒸水洗涤，40倍倒置显微镜下拍照，计数。

1.7 细胞划痕实验

检测各组划痕产生0、24、48、72 h后细胞体外迁移能力的变化。方法如下：于24孔板中接种每孔2×105，每组设3个复孔，细胞长至60%～80%融合时更换1%双抗无血清培养基，12～18 h后于每孔中央沿直线划痕，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗2次，更换全营养DMEM，荧光显微镜放大40倍拍照，沿细胞划痕自上至下取6～8个测量点，测量划痕宽度。

1.8 统计学分析

所有实验至少重复3次，采用SPSS 19.0软件统计分析所有数据，所有数值以均值±标准差来表示，组间比较采用t检验，P＜0.05记为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测结果

RT-qPCR结果（图1）显示，转染pLenti-shRNAHsp27慢病毒颗粒后有效抑制了Hsp27基因的表达。转染24 h后，shHsp27组中Hsp27 mRNA的表达量降至ctrl组的（6±0.56）%，高效沉默了Hsp27基因的表达，两组间的表达差异有统计学意义（P＜0.01）。shctrl组中Hsp27 mRNA表达量为ctrl组的（81±6.41）%，几乎不抑制Hsp27基因的表达。shHsp27组与shctrl组相比显著沉默了Hsp27基因的表达（P＜0.01）。

图 1 RT-qPCR检测结果Fig 1 The result of RT-qPCR

2.2 蛋白质印迹检测结果

蛋白质印迹检测结果（图2）显示，shHsp27组的Hsp27条带亮度较ctrl组明显降低，shctrl组条带亮度与ctrl组无明显差异。

图 2 蛋白印迹检测结果Fig 2 The result of Western blot

2.3 MTS细胞增殖实验检测结果

MTS细胞增殖实验检测结果（图3）显示，细胞培养24 h后，相同细胞数细胞吸光度值相近，各组细胞增殖分化能力的差异无统计学意义（P＞0.05）；细胞培养48 h后，shctrl组各细胞数量的细胞增殖能力均高于ctrl组和shHsp27组（P＜0.05），shHsp27组在细胞数量较高时，增殖能力高于ctrl组。

图 3 转染后细胞的增殖曲线Fig 3 Proliferation curves of transfected cells

2.4 Matrigel细胞侵袭实验结果

Matrigel细胞侵袭实验结果（图4、5）显示，ctrl组细胞侵袭能力为shHsp27组的2.03倍，shHsp27组的侵袭能力显著降低（P＜0.01），即shRNA沉默Hsp27基因后，细胞侵袭能力下降。shctrl组的平均细胞侵袭能力较ctrl组有所下降，shHsp27组与shctrl组相比，侵袭能力显著降低（P＜0.01）。

图 4 转染后细胞的侵袭能力 倒置显微镜 × 40Fig 4 Invasion of transfected cells inverteal microscope × 40

图 5 细胞侵袭实验穿膜细胞数Fig 5 Average cells number of invasion transfected cells

2.5 细胞划痕实验结果

细胞划痕实验结果（图6、7）显示，划痕产生24 h后，shctrl组与shHsp27组无明显差异（P＞0.05）；划痕产生48 h后，shctrl组迁移能力有所降低，shHsp27组较shctrl组迁移能力显著降低（P＜0.01）；划痕产生72 h后，shHsp27组较shctrl组迁移能力显著降低更加明显（P＜0.01）。各时间点shHsp27组较ctrl组细胞的迁移能力均显著降低（P＜0.01），划痕产生72 h后，ctrl组细胞迁移能力为shHsp27组的4.38倍，即shRNA沉默UM-SCC-22B细胞Hsp27基因后，其体外迁移能力显著降低。

3 讨论

近年来，随着环境污染加剧，吸烟、酗酒等不良生活习惯等因素的影响，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，头颈部鳞状细胞癌每年约有50万例新发患者。尽管随着医疗技术水平的提高和综合序列治疗等方法的运用，早期头颈部鳞状细胞癌的5年生存率达到了60%，但是其转移病例的术后存活时间仅为6个月[11-12]，区域性淋巴结转移或远处脏器转移是导致低存活率的主要因素[13]。在原发性实体肿瘤中，只有一小部分肿瘤细胞具备侵袭或转移的能力，高转移潜能细胞与低转移潜能细胞之间的基因表达也不同。因此，如何发现和确定肿瘤转移亚群的标记性基因或蛋白成为研究的热点。

Hsp27作为一种应激蛋白，与多种肿瘤的发生和转移有关，其表达程度与肿瘤分期及预后有一定的相关性。有研究发现，Hsp27在多种肿瘤中呈高表达状态，如前列腺癌[14]、人肝细胞肝癌[15-16]、舌鳞状细胞癌[17]、胃癌[18]等，被认为是预后不良的标志性因子。但仍有诸多研究[19-20]认为，Hsp27高表达预示着预后良好。不同组织来源的肿瘤、不同病理分型、不同个体间，Hsp27与肿瘤转移和侵袭的关系不完全一致。

因此，为了最大程度地降低个体差异和不同组织来源所造成的结果差异，本研究选取了来自同一患者的原发灶和同期存在的淋巴结转移灶的2种细胞系UM-SCC-22A/UM-SCC-22B，并在前期研究[10]中证实了随着头颈部鳞状细胞癌转移潜能的升高，Hsp27的表达也随之升高。

为了进一步证实Hsp27在头颈部鳞状细胞癌转移中的作用，本研究采用了基因工程技术，将能够稳定表达Hsp27 shRNA的慢病毒载体转染入高转移潜能头颈部鳞状细胞癌UM-SCC-22B细胞系中，通过体内外实验观察Hsp27基因与UM-SCC-22B迁移和侵袭能力的关系。

图 6 细胞划痕实验结果比较 电子显微镜 × 40Fig 6 Wound-healing assay results of transfected cells electric microscope × 40

图 7 细胞划痕减少百分比的比较Fig 7 Wound width reduced of transfected cells

经RT-qPCR和蛋白印迹检测，高效、特异地沉默了Hsp27基因的表达，通过MTS细胞增殖实验、细胞划痕实验、Matrigel细胞侵袭实验，证实了长效转染shRNA Hsp27慢病毒后，UM-SCC-22B的体外转移能力明显下降。其中，MTS细胞增殖实验发现，shctrl组的增殖能力增强，目前虽无理论依据揭示其原因，但此现象揭示了细胞划痕实验和Matrigel细胞侵袭实验的差异性结果并非由细胞增殖能力差异引起，而shHsp27组细胞增殖能力增强的同时侵袭和迁移能力降低，更进一步说明沉默Hsp27基因后，有效抑制了UM-SCC-22B的转移。

综上所述，本研究结果表明，长效转染慢病毒颗粒pLenti-shRNA-Hsp27能够高效、特异地沉默高转移潜能头颈部鳞状细胞癌细胞系UM-SCC-22B的Hsp27基因的表达，并能显著抑制其体外侵袭转移能力。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。