香椿子多糖脱蛋白脱色工艺及其体外抗凝血活性研究

闻志莹，蔡为荣，许 永，丁伯乐

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

人们生活水平越来越高的同时，血栓性疾病[1]日益增多，导致人体器官组织缺血及坏死[2]。在治疗血栓性疾病的过程中，肝素类物质[3]通常被作为抗凝血药物，但同时也伴随着一些副作用，如易导致血小板减少、出血等[3-4]。因此从天然产物中找寻具有抗凝血活性的物质,或者将其具有抗凝血活性成分的结构用来研究开发，在治疗和预防血栓性疾病方面将体现以下优点：降低不良反应、副作用少、高效低毒、原料来源广等[5]。

香椿子，又被称为椿树子，是楝科植物香椿(Toona sinensis)的果实，主要产于中国长江南北地区，具有较高的经济和药用价值[6]。《四川中药志》中指出香椿子没有毒性，性温，同时具有味辛、苦等特点。香椿子一般是被当做普通的药材进行利用，对于常见的流感风寒、胃疾病具有一定的效果，同时对痢疾、风湿关节痛[7]等也有一定的疗效，用途比较单一，使得香椿子资源没有被充分利用。多糖在生物体内广泛存在，是生物体内3种不可或缺的大分子物质之一[8]，并在生物体生命活动中起到非常重要的作用[9-13]。香椿子的主要成分之一为多糖[14]，其具有抗氧化[15]、抗凝血[16]等生理功能。香椿子粗多糖是混合物，在初提的时候会产生一些杂质[17]，如色素类、蛋白质等，在很大的程度上会对多糖后期的分离纯化以及生物活性造成影响[18]。因此，为了保证香椿子多糖的纯度和活性，寻找对香椿子多糖脱蛋白率高、脱色效果好、且多糖保留率高的脱蛋白脱色工艺非常重要。目前，关于香椿子多糖的提取工艺[15]已有报道，对香椿子粗多糖抗凝血活性[16]的研究鲜有报道，而关于香椿子多糖制备过程中的脱蛋白、脱色工艺及其所得精多糖的抗凝血活性却未见报道。

因此，实验以香椿子为原料，以多糖保留率、蛋白质去除率和脱色率作为评价指标，比较TCA、Sevag和聚酰胺法3种方法对香椿子多糖的脱蛋白效果，首次利用活性炭脱色法进行正交优化工艺，在此条件下确定较优的脱蛋白方法及活性炭脱色工艺，并对脱蛋白、脱色后制备得到的香椿子多糖的抗凝血功能进行相关的探究，进一步研究香椿子多糖的抗凝机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香椿子(亳州药材店);聚酰胺(80目,浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);牛血清白蛋白(上海博奥生物科技有限公司);考马斯亮蓝G-250(Sigma公司);APTT、PT、TT测定试剂盒(上海太阳生物科技有限公司);肝素钠(北京索莱宝科技有限公司);苯酚,无水乙醇(天津科密欧化学试剂有限公司);活性炭(粉末状)、葡萄糖、三氯乙酸、浓硫酸(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器与设备

RE-85Z旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂);HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);SHB循环水式真空泵(郑州市上街华科仪器厂);L3S可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司);UVmini-1280紫外可见分光光度计(日本岛津);真空冷冻干燥机(美国SIM公司);MTN-Ⅱ血凝仪(长春市曼特诺医疗器械有限公司)。

1.3 实验方法

(1)香椿子多糖制备工艺流程图如图1所示。

图1 香椿子多糖制备工艺流程图

(2)香椿子粗多糖的提取。将香椿子70 ℃烘干，然后将其粉碎、过80目筛。称取香椿子粉末，按照响应面最优条件(料液比1∶25、82.5 ℃、92 min、提取1次)提取粗多糖。将香椿子提取液通过离心、抽滤处理后得到粗多糖滤液，然后利用真空浓缩的方式在50 ℃进行浓缩，直至达到原体积的三分之一，向浓缩后的液体中加入4倍体积的无水乙醇，然后进行揽拌，接着将样品放在冰箱中，4 ℃醇沉。24 h后，将溶液进行低速离心(4 000 r/m,20 min)得到沉淀，并用无水乙醇洗涤多次，然后将沉淀加水复溶，用旋转蒸发仪除去酒精后，冷冻干燥得到香椿子粗多糖(CSTSP)。

(3)香椿子粗多糖脱蛋白。

①不同脱蛋白方法。

Sevag[19]法脱蛋白：取40 mL 2 mg/mL香椿子粗多糖溶液，然后加入相同体积的Sevag，振荡30 min后以4 000 r/m转速处理样品30 min，按照相同步骤处理样品两次，然后取上清液测多糖保留率和蛋白质去除率。

TCA法脱蛋白：取40 mL 2 mg/mL香椿子粗多糖溶液，加入2.0 mL TCA(4 mol/L)溶液，混合均匀后将样品于4 ℃冰箱中保存，24 h后离心(4 000 r/m,15 min)。取上清液，测香椿子多糖保留率和蛋白质去除率。

聚酰胺法[20]脱蛋白(静态聚酰胺法)：取40 mL 2 mg/mL香椿子粗多糖溶液，然后加入聚酰胺粉1.4 g，将其在室温26 ℃的条件下振荡2 h(110 r/min)。待振荡结束后，将其进行抽滤、离心，保留上清液，然后计算多糖的保留率和蛋白质去除率。

②紫外光谱分析[21]。将未脱蛋白的香椿子粗多糖和最佳脱蛋白方法脱蛋白的香椿子多糖分别配成0.2 mg/mL的溶液，然后分别在200～400 nm内用紫外可见分光光度计进行扫描，观察多糖紫外可见光谱特征。

(4)活性炭脱色[22]。

①单因素实验。

以脱色率、多糖保留率作为评价指标，研究4个单因素指标对香椿子多糖(已脱蛋白)的脱色影响，单因素实验设计如下：

活性炭添加量(A)：将香椿子多糖配成4 mg/mL，设定温度50 ℃，时间1.5 h,pH为6，活性炭的添加用量依次递增，分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，测定香椿子多糖保留率和脱色率。

脱色温度(B):将香椿子多糖配成4 mg/mL，设定时间1.5 h,pH为6，活性炭添加量最优条件为已确定的A，脱色温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，测定香椿子多糖保留率和脱色率。

脱色时间(C):将香椿子多糖配成4mg/mL，设定样液pH为6，活性炭添加量与脱色温度的最优条件为已确定的A、B，脱色时间为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h,测定香椿子多糖保留率和脱色率。

样液pH(D):将香椿子多糖配成4 mg/mL，A、B、C最优条件已确定，样液pH为4、5、6、7、8，测定香椿子多糖保留率和脱色率。

②正交实验。

根据单因素实验，选择4个因素中影响较大的3个水平，按L9(34)正交表进行实验，因素水平如表1所示。

表1 活性炭脱色正交实验因素水平表

(5)香椿子多糖体外抗凝血活性实验。将血浆(健康志愿者处获得)和柠檬酸钠(质量体积分数为3.8%)按体积比(9∶1)混匀，离心(3 600 r/m,15 min)收集上清液，将其置于真空采血管内，4 ℃保存。取经脱蛋白脱色工艺制备得到的香椿子多糖(STSP)，将其溶于生理盐水，配成质量浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL的样品；然后将待测血浆和香椿子多糖溶液按4∶1的体积比混匀；生理盐水作为阴性对照，肝素钠作为阳性对照，然后进行体外抗凝血活性研究。

①APTT的测定。取50 μL待测样液(多糖与血浆混匀)，37 ℃预热3 min后加入等体积APTT试剂，保温5 min后，再加入50 μL 37 ℃预热的CaCl2溶液，同时用仪器记录凝血时间。

②PT的测定。取50 μL待测样液(多糖与血浆混匀)，37 ℃预热3 min后加入50 μL PT试剂，同时用仪器记录凝血时间。

③TT的测定。取50 μL待测样液(多糖与血浆混匀)，37 ℃预热3 min后加入50 μL TT试剂，同时用仪器记录凝血时间。

④统计分析。所有的试验都进行3次平行的重复试验，最终的实验结果利用Minitab 15软件进行分析。

(6)多糖含量及多糖保留率的测定。采用苯酚-硫酸法在490 nm下测定香椿子中的多糖含量。线性方程为：

Y1=11.478X1-0.019 3，

式中，X1为葡萄糖质量浓度(mg/mL)；Y1为吸光度(A)；R2=0.999 2，线性范围0～0.10 mg/mL。多糖保留率的测定按照式(1)计算。

(1)

式中,A1指脱蛋白前(脱色前)香椿子多糖溶液中多糖的含量；A2指脱蛋白后(脱色后)香椿子多糖溶液中多糖的含量。

(7)蛋白质含量及蛋白质去除率的测定。采用考马斯亮蓝G-250法。线性方程为:

Y2=8.902 1X2-0.007 2，

式中,X2为蛋白质含量;Y2为吸光度;R2=0.994 8，线性范围0～0.1 mg/mL。蛋白质去除率按照式(2)计算。

(2)

式中,B1指脱蛋白前香椿子多糖溶液中蛋白质的含量；B2指脱蛋白后香椿子多糖溶液中蛋白质的含量。

(8)脱色率的测定。将脱色前的香椿子多糖溶液在紫外420 nm波长下测吸光度，脱色后的香椿子多糖溶液在490 nm波长下测吸光度。脱色率按照式(3)计算。

(3)

式中,C1、C2指脱色前、脱色后香椿子多糖溶液中色素的吸光度。

(9)数据处理：综合加权评分法[23]。综合指标为：以脱色率、多糖保留率作为评分指标，然后将指标的最大值作为参照将数据进行归一化。脱色率和多糖保留率的权重系数各为0.5。综合评分按照式(4)来计算。

(4)

式中,X指脱色率;Y指多糖保留率；Xmax指脱色率最大值；Ymax指多糖保留率最大值。

2 结果与分析

2.1 香椿子多糖脱蛋白

(1)脱蛋白方法的比较。不同方法对多糖保留率和蛋白质去除率的影响如图2所示。由图2可以看出，3种脱蛋白方法对香椿子粗多糖都有一定的脱蛋白效果。从蛋白质的去除率进行比较，在3种脱蛋白方法中，聚酰胺法的脱蛋白效果是最好的，它的蛋白质去除率达到68.15%，其次是TCA法，而Sevag的脱蛋白效果相比其他两种效果差了很多，Sevag的蛋白质去除率为28.89%，效率仅达到聚酰胺法的42.39%；从多糖保留率方面进行比较，效果最好的是Sevag法，它的多糖保留率能够达到92.19%，然后是聚酰胺法(88.09%)，可能是因为TCA法本身是一种反应比较剧烈的脱蛋白方法，TCA会与蛋白质结合形成沉淀，且当TCA质量浓度过高时会破坏多糖的活性结构，引起多糖糖苷键断裂，易造成部分多糖降解[24]，从而导致多糖损失相比较其他两种方法较多。

综合多糖保留率和蛋白质去除率两个方面，可以确定静态聚酰胺法对香椿子粗多糖脱蛋白的效果比其他两种方法好，其多糖保留率可以达到88.09%，蛋白质去除率达到68.15%，最终确定聚酰胺法作为香椿子多糖的脱蛋白方法。

(2)脱蛋白前后紫外光谱分析。香椿子多糖脱蛋白前后紫外可见光谱图如图3所示。由图3可以看出，未进行脱蛋白时，香椿子粗多糖在260～280 nm处有一个吸收峰，说明存在蛋白质和核酸；而脱蛋白后的香椿子粗多糖在260～280 nm处没有出现吸收峰，表明没有蛋白质和核酸的存在，进一步说明了通过聚酰胺法对香椿子多糖进行脱蛋白处理，可以达到很好的效果。

图2 不同方法对多糖保留率和蛋白质去除率的影响 图3 香椿子多糖脱蛋白前后紫外可见光谱图

2.2 香椿子多糖活性炭脱色工艺研究

(1)活性炭脱色的单因素实验结果。活性炭不同单因素实验对香椿子多糖的脱色率和多糖保留率的影响结果如图4所示。

①活性炭添加量对脱色效果的影响。由图4a可知，香椿子多糖的脱色率和前期活性炭的用量呈现的曲线呈正相关的关系，当活性炭用量增多，脱色率会增大，但是当用量高于1.5%时，脱色率增加的速率会降低，而香椿子多糖保留率后期下降的速度较为缓慢，可能是因为后期加入了过量的活性炭，从而对多糖产生吸附[25]，所以，活性炭的加入量选择范围为1.0%～2.0%。

②脱色温度对脱色效果的影响。由图4b可知，随着脱色温度的升高，香椿子多糖脱色的增长速率先增大后减小。当60 ℃时，香椿子多糖脱色的速率达到了最大化,随后其脱色速率呈现减小趋势，这可能是因为温度较高时，加快了分子扩散运动，从而导致色素分子与活性炭达到饱和效果[23]。而另一方面，随着温度的上升，多糖保留率下降的趋势较为明显，可能是温度升高，导致多糖活性丧失，从而影响其保留率,所以脱色温度选择为50 ℃～70 ℃。

③脱色时间对脱色效果的影响。由图4c可知，随着时间的延长，香椿子多糖的脱色率呈现缓慢上升的趋势。当时间大于1 h时，其脱色率上升的速率减慢，原因可能是活性炭对多糖中的色素的吸附达到了饱和状态[23]，从而使色素的脱除率降低。多糖保留率在1～2 h内降低趋势较小。

④pH对脱色效果的影响。由图4d可知，在pH为5时，香椿子多糖保留率达到最大；随着pH值的增大，其脱色率在不断地降低，这说明了样液偏酸性时，活性炭对香椿子多糖中的色素吸附作用较好。因此，选择样液pH范围为4～6。

图4 不同单因素(活性炭添加量、脱色温度、脱色时间、pH)对脱色率和多糖保留率的影响

(2)正交试验设计及结果。活性炭脱色正交实验结果如表2所示。活性炭脱色方差分析结果如表3所示。根据表2和表3可知，在活性炭法对香椿子多糖进行脱色的试验中，综合评分的影响因素大小顺序为：C>B>D>A，即脱色时间对脱色效果影响最大，其次为脱色温度，然后是pH，活性炭添加量影响最小。香椿子多糖活性炭法脱色的最优工艺：A3B2C1D1，即活性炭用量达到2.0%，脱色温度为60 ℃，脱色时间为1 h，pH为4。在此优化条件下进行3次脱色验证实验，得到香椿子多糖保留率80.23%，脱色率64.58%，表明试验所确定的最优脱色工艺条件可靠。

2.3 香椿子多糖的抗凝血活性研究

STSP对APTT、PT、TT的影响如表4所示。从表4可以看出，与生理盐水比较，STSP对APTT的影响较弱。随着其质量浓度的增加，APTT的时间增加幅度不是很大，说明香椿子多糖不是通过参与内源性凝血途径来发挥抗凝血作用；在质量浓度2～4 mg/mL范围内，STSP对PT和TT的影响达到显著性水平(P<0.01或P<0.05)。当香椿子多糖的质量浓度达到4 mg/mL时，与生理盐水相比，STSP可以显著地延长PT和TT的时间，分别延长了47.66%和36.86%。说明香椿子多糖具有较好的抗凝血活性，其可通过参与外源性凝血途径或共同途径来发挥抗凝血作用。

表2 活性炭脱色正交实验结果

表3 活性炭脱色方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

表4 STSP对APTT、PT、TT的影响

注：表中数据为平均值±标准差，n=3。其中：**表示与生理盐水相比P<0.01；*表示与生理盐水相比0.01

3 结论

实验采用3种脱蛋白方法对香椿子粗多糖进行脱蛋白处理，对比其他两种方法，聚酰胺法对香椿子多糖脱蛋白效果较好，多糖保留率为88.09%，蛋白质去除率为68.15%；采用活性炭法对脱蛋白后的香椿子多糖进行正交L9(34)优化脱色工艺研究，结果发现，当活性炭用量达到2.0%，脱色温度为60 ℃，脱色时间为1 h，pH为4时，其脱色效果最好，在此条件下多糖保留率为80.23%，脱色率为64.58%。体外抗凝血实验表明，经聚酰胺法，最优活性炭工艺处理后制备得到的香椿子多糖具有一定的抗凝血活性作用，表明其是通过影响外源性凝血途径或共同途径来发挥抗凝血作用的。研究结果可为香椿子粗多糖纯化及抗凝血活性的研究提供基础。