植物源性饲料添加剂对猪肉品质相关基因表达量影响研究

郭雪丽，刘泽民，王红宝，刘一飞，温永亮

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

猪肉是我国人民生活中不可缺少的食品，随着人们生活水平的提高，人们对猪肉已不再是量的需求，对猪肉的品质也有了较高的要求。影响猪肉品质的因素包括遗传因素和非遗传因素，遗传因素是决定猪肉品质的根本。目前已发现20多个影响猪肉品质的相关基因，主要包括氟烷（Hal）基因、钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因、脂蛋白脂肪酶（LPL）基因、猪心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因、MyoD基因等[1-2]。根据相关文献[3-4]，猪心型脂肪酸结合蛋白（HFABP）基因是影响猪肉品质的主要候选基因，脂蛋白脂肪酶（LPL）是影响动物机体组织脂肪沉积过程的关键酶，猪肌肉的生长过程中蛋白质的更新有钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因参与，MyoD基因能够控制猪肉肌纤维的发育。

长期以来，抗生素、化学药品等的毒副作用以及耐药性严重影响了养殖业的发展，尤其是药物残留问题，威胁着人类的健康，已成为一个全社会关注的问题。植物源性饲料添加剂的毒副作用小，无耐药性，不会在畜产品中产生有害残留，是植物源性饲料添加剂的一个独特优势，这一优势顺应了时代潮流，满足了人们回归自然、追求绿色食品的愿望。总的来说，植物源性饲料添加剂具有来源天然性、功能多样性、安全可靠性、经济环保性等特点。合理组配的植物源性饲料添加剂常常具有多种功能，这些性能与作用是化学物质不可比拟的。

本研究于2019年6月至12月在山西省大同县春源生态养殖专业合作社进行，通过植物源性饲料添加剂组方饲喂山西地方品种试验猪，利用荧光定量PCR技术对试验猪的脂肪酸结合蛋白（HFABP）、钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、肌细胞生长素（MyoG）、糖激酶同工酶基因（HK）、ATP合成酶（ATP5B）、磷酸果糖激酶（PFK）7个肉质相关基因进行了测定，对其表达量进行了分析研究，以探讨植物源性饲料添加剂对猪肉品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 试验猪 晋阳白猪、山西黑猪各36头，共72头。体重约15 kg左右，由大同县春源生态养殖专业合作社提供。

1.1.2 试剂

（1）植物源性饲料添加剂组方Ⅰ：主要由黄芪、党参、白术等按一定比例混合制成；植物源性饲料添加剂组方Ⅱ：主要由白术、党参、苏子、陈皮、神曲等按一定比例混合制成。植物源性饲料添加剂原料购自河北省安国市祁瑞中药材有限责任公司，并由该公司将原料制成超微粉剂，粉剂粒度300目以上。

（2）Trizol提取试剂盒；4S Red Plus核酸染色剂；琼脂糖。氯仿：异戊醇（24∶1）；无水乙醇；DEPC H2O。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

（3）第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo Scientific EP0733）。由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.3 仪器 SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；HC-2518R高速冷冻离心机（安徽中科中佳仪器有限公司）；DYY-6C型稳压稳流电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；FR980凝胶成像系统（上海复日科技有限公司）；TU-1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；PCR反应扩增仪（BIO 公司）；移液器（范围 100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL； 加拿大 BBI 公司）；LightCycler480 Software Setup（Roche罗氏）。

1.2 方法

1.2.1 试验猪饲养及采样方法 选择体重无显著差异的山西黑猪、晋阳白猪各36头，每个品种猪均分为4个处理，每个处理3个重复，每个重复3头试验猪。4个处理分别为植物源性饲料添加剂Ⅰ组、植物源性饲料添加剂Ⅱ组、抗生素组、对照组。植物源性饲料添加剂Ⅰ组在基础饲粮中加入1%的植物源性饲料添加剂组方Ⅰ；植物源性饲料添加剂Ⅱ组在基础饲粮中加入1%的植物源性饲料添加剂组方Ⅱ；抗生素组在基础饲粮中添加金霉素，添加量50 g/t；对照组只饲喂基础饲粮。各组预试期均15 d，正式试验期均120 d。

达到试验天数后，每组选3头猪禁食12 h，自由饮水，然后屠宰。屠宰时取背最长肌胸段（第8肋骨至第1腰椎处），所取样品用锡纸包好，装入冻存管，标号后立即放入液氮，送实验室转入-80℃冰箱保存。

1.2.2 引物设计 利用Primer Premier 5.0软件设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，详见表1。

表1 引物序列

1.2.3 RNA抽提及检测 DNAseI编号是B300065-0001；洗液DW的编号是B900042-1000；Buffer RDD是用来配DNA酶的，编号是B900042-1000。DNA酶的配制：DNA 酶 30 μL，加 RDD 40 μL，加 DEPC水 10 μL；DW 洗液的配制：DW∶无水乙醇=9∶1。

样品准备：将样品剪碎后直接在Trizol中研磨，15～25 mg样品组织加入0.5 mL Trizol，用匀浆器匀浆处理。将匀浆液室温放置5～10 min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡30 s，室温放置3 min。12 000 r/min 4℃离心10 min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1/2倍体积无水乙醇，混匀。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置 2 min，12 000 r/min离心3 min，倒掉收集管中废液。

将吸附柱放回收集管中，加入500 μL rpe Solu－tion，静置 2 min，10 000 r/min 离心 30 s，倒掉收集管中废液，并重复该步骤1次。将吸附柱放回收集管中，10 000 r/min离心2 min。将吸附柱放入干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30 mL DEPC-treated ddH2O，静置 5 min，12 000 r/min 离心 2 min，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续试验。

1.2.4 反转录 按照第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase，Thermo ScientificTMEP0733）的要求进行反转录。在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂：Random Primer p（dN）6（100 pmol）1 μL，dNTP Mix（0.5 mM final concentration）1.0 μL，Rnase-free ddH2O 定容至14.5 μL。轻轻混匀后离心3～5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴2 min，然后离心3～5 s。将试管冰浴，再加入下列试剂：5*RT Buffer 4.0 μL，Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor（20 U）0.5 μL， RevertAid Premium Reverse Transcriptase（200 U）1.0 μL，轻轻混匀后离心 3～5 s。 在 PCR 仪上按照下列条件进行反转录反应：1）25℃孵育10 min；2）cDNA 合成 50 ℃ 30 min；3）终止反应 85 ℃5 min，处理后，置于冰上放置。将上述溶液-20℃保存。

1.2.5 荧光定量PCR检测 将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测。反应体系和反应条件见表2和表 3。 20 μL 反应体系：SybrGreen qPCR Master Mix（2◇）10 μL；10 μmol/L 的上游引物和下游引物各 0.4 μL；DNA 模板 2 μL；ddH2O 7.2 μL。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性7 s，57℃变性10 s，变性72℃变性15 s，45个循环。将加好样品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche罗氏）中进行反应。

表2 反应混合液

表3 PCR循环条件

1.3 数据统计分析

试验数据用Microsoft Excel 2013记录并整理，采用 2-（△△Ct）法计算反转录结果。 运用 IBM SPSS Statistics 22程序对整理好的数据进行方差分析和邓肯氏多重比较，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

试验猪肉质相关基因荧光定量PCR测定分析结果见下表4。

表4 猪肉质相关基因荧光定量PCR分析结果

通过以上对试验猪肉质相关基因荧光定量PCR测定结果数据分析可知，使用植物源性饲料添加剂的试验猪，其各相关基因的表达量均极显著高于对照组（P<0.01），并极显著高于抗生素组。植物源性饲料Ⅱ组又极显著高于植物源性饲料Ⅰ组（P<0.01）。山西黑猪植物源性饲料Ⅱ组中H-FABP基因、LPL基因表达量显著高于晋阳白猪（P<0.05），其余各基因均为晋阳白猪高于山西黑猪。

3 讨论

本研究说明，植物源性饲料添加剂对猪肉品质的改善有着较好的促进作用，抗生素的不当应用会影响猪肉品质。从本研究的整体来看，植物源性饲料Ⅱ组，即白术、党参、苏子、陈皮、神曲等按一定比例的配制提升猪肉品质效果更强，对晋阳白猪的肉质提升效果更好。

本研究主要对猪肉品质相关基因H-FABP、CAST、LPL、MyoG、HK、ATP5B、PFK 进行了测定。H-FABP属脂肪酸结合蛋白（Fat acid binding proteins,FABPs）的家族之一，主要存在于骨骼肌、心肌、泌乳的乳腺及脂肪酸中[5-6]，参与细胞内脂肪酸的运输，与猪肉的肌内脂肪含量相关。猪肉的品质与肌内脂肪（Intramuscular fat,IMF）密切相关[7]，近年来研究认为H-FABP是与猪肉品质研究的主要候选基因[3-4]。CAST是一种内源性专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白，主要参与机体的成长和代谢过程[8]，其基因的产物参与猪肌肉生长过程中蛋白质的更新[9]；是影响肌肉生长和宰后肉嫩化的一个重要因素，屠宰后可抑制钙蛋白酶的活性，降低蛋白质水解[10]。肉的嫩度是肉品质的一个重要方面。研究发现，钙蛋白酶系统在肉的嫩化，改善肉质中起着重要的作用[11]。LPL的主要作用是能促进沉积动物组织中的脂肪，将动物血液中的低密度脂蛋白以及乳糜微粒携带的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，提供脂肪组织合成甘油三酯的原料。在动物的脂肪代谢中起着关键性作用[12]。MyoG主要通过调节肌肉分化阶段特异性蛋白的表达来参与肌细胞决定和分化，在肌肉分化过程中起关键作用，也是影响猪肉品质的一个重要基因[13-17]。HK、ATP5B、PFK对猪肉品质的改善均有一定的辅助作用[18-19]。