医用透明质酸钠凝胶对肿瘤生长和转移影响的实验研究

蔡同凯，杨文胜，曹永兵,3，韩 华，阎 澜 （.海军军医大学药学系，上海 00433；.同济大学医学院，上海0009；3.上海中西医结合医院脉管病研究所，上海 0008）

透明质酸钠（图1）又称玻璃酸钠，是由交替的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和葡糖醛酸（GlcA）单元组成[1]的聚合物，聚合度最大的相对分子质量（Mr）可以达到107。具有高度黏弹性、可塑性、渗透性、独特的流变学特性以及良好的生物相容性等特点[2]。透明质酸钠广泛存在于人体，是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内具有保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复等重要生理功能[3]。医用透明质酸钠凝胶（HA）为无色透明黏稠液体，主要成分为透明质酸钠。HA 常用于肿瘤患者术后的抗粘连，其广泛的生理学活性有可能使得肿瘤细胞易于扩增和转移，文献报道内源性的透明质酸能促进肿瘤增殖[4-6]。因此，本研究考察外源性HA 是否会促进肿瘤的生长和转移，以明确HA 是否可用于肿瘤患者的术后防粘连。为HA 用于肿瘤患者腹、盆腔手术术后防粘连提供实验依据。

图 1 透明质酸钠的结构式

1 仪器和材料

1.1 实验材料

医用透明质酸钠凝胶（HA，10 mg/ml，上海昊海生物科技股份有限公司，批号：18052122，Mr≥1.0×106），氟尿嘧啶注射液（5-Fu，上海旭东海普药业有限公司，批号：FA1800416），胎牛血清（FBS，Gibco，批 号：1932595），McCoy’s 5A Medium（Gibco，批号：1967679），RPMI Medium 1640（Gibco，批号：1967664），MEM（Minimum Eagle’s Medium，HyClone，批号：AD20532472），胰酶（Trypsin，上海博光生物科技有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS，上海博光生物科技有限公司），MTT（上海博光生物科技有限公司），无水甲醇、二甲基亚砜（DMSO，国药集团化学试剂有限公司），生物胶（批号：217201N2）、小鼠结肠癌细胞（CT26，上海中西医结合医院），人宫颈癌细胞（Hela）、人结肠癌细胞（HCT116，中国科学院上海生命科学研究院）。

1.2 实验动物

裸鼠：88 只，上海斯莱克实验动物有限公司，SPF 级，SCXK（沪）2017-0005；64 只，上海灵畅生物科技有限公司，SPF 级，SCXK（沪）2018-0003），动物饲养于同济大学沪北校区（SYXK（沪）2018-0034）。所有动物实验过程均符合实验动物伦理学要求。

1.3 实验仪器

酶标仪1510-00411C（Thermo），坤宏BMB224分析天平（南京伯尼塔科学仪器有限公司），ECLIPSE TE100 显微镜（Nikon），细胞培养箱（Thermo）。

2 实验方法

2.1 MTT 法检测肿瘤细胞的生长

将状态良好的肿瘤细胞用胰酶消化后离心，弃上清液，分别用对应培养液重悬成单个肿瘤细胞悬液，显微镜下计数，然后分别稀释成以下浓度：Hela（2×104个/ml），CT26（5×103个/ml），HCT116（104个/ml）。取96 孔板，空白对照孔接入100 μl培养液，其余各孔接入肿瘤细胞混悬液，每孔100 μl，将96 孔板置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。24 h后吸弃培养液，空白对照和阴性对照孔分别加入200 μl 培养液，测试孔分别加入100%HA、50%HA+50%培养液、25%HA+75%培养液、12.5%HA+87.5%培养液、6.25%HA+93.75%培养液，每孔200 μl；阳性对照孔分别加入5-Fu 浓度为 16、8、4、2、1 μg/ml 培养液，每孔200 μl，将加药96 孔板放回培养箱培养。分别培养3、5 和7 d 后，吸弃上层液体，加入含0.5 mg/ml MTT 的培养液100 μl，培养4 h。避光处吸弃上层液体，每孔加入100 μl DMSO，避光反应10 min，振荡1 min，在酶标仪波长570 nm处（630 nm 校准）测量各孔的吸光值。细胞存活率=（实验孔吸光值—空白对照孔吸光值）/（阴性对照孔吸光值—空白对照孔吸光值）×100%。

2.2 Transwell 检测肿瘤细胞的迁移

将状态良好的肿瘤细胞胰酶消化、离心后，分别用对应空白培养液重悬成单个肿瘤细胞悬液，显微镜下计数，然后分别稀释成以下浓度：Hela（1.5×105个/ml），HCT116（5×105个/ml）。分别将肿瘤细胞混悬液和HA 混匀，配成50%HA+50%肿瘤细胞悬液、25%HA+50%肿瘤细胞悬液+25%空白培养液、12.5%HA+50%肿瘤细胞悬液+37.5%空白培养液、50%肿瘤细胞悬液+50%空白培养液。将肿瘤细胞和HA 混合液加入Transwell 上层小室中，每个小室200 μl，Transwell 下层腔室分别加入含10% FBS 对应培养液 600 μl。将Transwell 培养板放入培养箱，培养24 h。取出Transwell 小室，轻轻吸弃小室内培养液，用PBS 洗1 遍，甲醇固定15 min。用棉签轻轻擦去小室内层细胞，PBS 洗2 遍，加入结晶紫（0.1%）染色，室温放置20 min，PBS 洗3 遍。显微镜10 倍物镜下观察、拍照和记数。

2.3 原位种植瘤法考察裸鼠体内肿瘤的生长

PBS 重悬HCT116 细胞，调浓度至107个/ml，将细胞接种于裸鼠皮下，每只动物0.2 ml，共12 只，作为供瘤体。视肿瘤生长情况将裸鼠处死，取出瘤块，选取瘤块实质性部分，用生理盐水冲洗干净，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 瘤块备用。

实验动物腹腔麻醉，取腹部正中切口，逐层开腹，找到盲肠位置。假手术组：将盲肠拉出后放回腹腔，逐层缝合伤口。其余组：轻轻划破结肠浆膜，用生物胶将瘤块固定在浆膜破损处。模型组和阳性对照组在瘤块接种处涂抹生理盐水0.07 ml，HA 组涂抹HA 0.02 ml。逐层缝合伤口，观察记录裸鼠状态，5-Fu 组腹腔注5-Fu 20 mg/kg，隔天给药，持续3 周。

瘤块接种4 周后将裸鼠处死，打开腹腔，用游标卡尺测量瘤块的长短径，按公式（V=ab2/2，a：瘤体最长直径；b：瘤体最短直径）计算体积，剥离瘤块，瘤块称重。

2.4 原位种植瘤法考察裸鼠体内肿瘤的转移

建立裸鼠结肠原位种植结肠癌CT26 模型，方法同“2.3”项。瘤块接种4 d 后，5-Fu 组腹腔注射氟尿嘧啶注射液50 mg/kg，隔3 d 给药一次，共4 次。

瘤块接种3 周后将裸鼠脱颈处死，打开腹腔，观察肿瘤转移情况，取肺和肝脏，4%多聚甲醛固定、切片、HE 染色，统计肿瘤转移率和转移病灶数。

2.5 统计方法

3 结果

3.1 HA 体外对肿瘤细胞生长的影响

在体外实验中，肿瘤细胞Hela、HCT116 和CT26 在100% HA 中均不能生长（图2）。Hela 细胞在培养3 d 和5 d 时不同含量HA 均不影响细胞的生长，7 d 时25%HA 和50%HA 细胞生长率低于阴性对照组（P＜0.001）。HCT116 细胞培养7 d 时，50%HA 细胞生长率低于阴性对照组（P＜0.01）。CT26 细胞培养3 d 时12.5%HA、25% HA 和50%HA细胞生长率低于阴性对照组（P＜0.001）；培养5 d 和7 d时，50%HA 细胞生长率低于阴性对照组（P＜0.001）。不同浓度5-Fu，培养3 d、5 d 和7 d 均抑制肿瘤细胞Hela、HCT116 和CT26 的生长，呈剂量相关性。

图 2 MTT 法考察不同浓度HA 体外对肿瘤细胞Hela、CT26 和HCT116 生长的影响

3.2 HA 体外对肿瘤细胞迁移的影响

Transwell 实验结果显示，高浓度HA 体外抑制肿瘤细胞迁移。50%HA、25%HA 和12.5%HA 组Hela 细胞穿透数均低于阴性对照组（P＜0.01），HA 含量越高，Hela 细胞穿透数越少；50%HA 和12.5%HA 组HCT116 细胞穿透数均低于阴性对照组（P＜0.05），25%HA 组HCT116 细胞穿透数低于阴性对照组，无统计学差异（图3）。

图 3 Transwell 法考察对肿瘤细胞迁移的影响（100×）

3.3 HA 体内对肿瘤细胞生长的影响

裸鼠结肠原位接种HCT116 瘤块后，HA 组与模型组成瘤率均为100%，结果无差异。模型组裸鼠的瘤体体积达（339.1±258.0）mm3，5-Fu 组裸鼠的瘤 体 体 积 为（128.5±111.9）mm3，小 于 模 型 组（P＜0.01），HA 组裸鼠的瘤体体积为（293.2±190.6）mm3，与模型组比较，差异无统计学意义；模型组裸鼠的瘤重为（0.359±0.219）g，5-Fu 组裸鼠的瘤重为（0.149±0.105）g，小于模型组（P＜0.001），HA 组裸鼠的瘤重为（0.330±0.187）g，与模型组比较，差异无统计学意义。使用一定剂量的HA 在裸鼠体内不影响HCT116 的成瘤率，同时也不影响HCT116 肿瘤的生长（表1）。

3.4 HA 体内对肿瘤细胞转移的影响

裸鼠结肠原位接种CT26 瘤块，观察16 d 后出现动物死亡，第18 天处死存活裸鼠。模型组存活率为62.5%，HA 组存活率68.8%，5-Fu 组存活率100%，体内使用一定剂量的HA 不影响裸鼠的存活率。模型组肝脏转移率90%，平均病灶数（2.2±1.7）；5-Fu 组肝脏转移率0.0%，低于模型组（P＜0.001）；平均病灶数（0.0±0.0），低于模型组（P＜0.001）。HA 组肝脏转移率36.4%，低于模型组（P＜0.05）；平均病灶数（0.6±1.0），低于模型组（P＜0.01）。模型组肺转移率为40%，平均病灶数（0.5±0.7）；5-Fu 肺 转 移 率6.3%，低 于 模 型 组（P＜0.05）；平均病灶数（0.1±0.3），低于模型组（P＜0.05）。HA 组肺转移率为18.2%，平均病灶数（0.2±0.4），与模型组均无统计学差异，见表2、图4和图5。

4 讨论

很多胚胎迁移和增殖速率与胚胎组织中高浓度的透明质酸有关，而肿瘤组织和胚胎发育很相似，几十年前已经提出透明质酸可能对肿瘤生长很重要[7-9]。然而，本研究的HA 为外源性高分子量HA，结果与内源性透明质酸结果不一致。在体外实 验 中，Hela、CT26 和HCT116 的 细 胞 无 法 在100% HA 中生长，表明HA 不能作为肿瘤细胞培养基。此外，细胞生长速率随着HA 的增加而不同程度的降低，说明高浓度HA 可以抑制肿瘤生长，在低浓度时虽然没有明显的抑制作用，但也未促进肿瘤的增殖。体内结果证明，外源性HA 对肿瘤细胞的生长无促进作用。

表 1 HA 在裸鼠体内对HCT116 肿瘤生长的影响

表 1 HA 在裸鼠体内对HCT116 肿瘤生长的影响

**P＜0.01、***P＜0.001，与模型组比较

组别 动物数（只） 成瘤数（只） 成瘤率（%） 瘤体积（V/mm3） 瘤重（m/g）假手术组 16 0 0 0.0 ± 0.0 0.000 ± 0.000模型组 16 16 100 339.1 ± 258.0 0.359 ± 0.219 HA组 16 16 100 293.2 ± 190.6 0.330 ± 0.187 5-Fu组 16 14 87.5 128.5 ± 111.9** 0.149 ± 0.105***

表 2 HA 在裸鼠体内对CT26 肿瘤转移的影响

表 2 HA 在裸鼠体内对CT26 肿瘤转移的影响

*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001，与模型组比较

肝转移 肺转移组别 动物数（只） 成活率（%）转移率（%） 病灶数 转移率（%） 病灶数假手术组 15 100.0 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 0.0 ± 0.0模型组 16 62.5 90.0 2.2 ± 1.7 40.0 0.5 ± 0.7 HA 组 16 68.8 36.4* 0.6 ± 1.0** 18.2 0.2 ± 0.4 5-Fu 16 100.0 0.0*** 0.0 ± 0.0*** 6.3* 0.1 ± 0.3*

图 4 HA 体内对CT26 肿瘤细胞肺转移的影响（40×）

图 5 HA 体内对CT26 肿瘤细胞肝转移的影响（40×）

内源性低分子质量透明质酸（low molecular weight hyaluronan，LMWHA）可诱导细胞运动[10-11]，促进血管生成，增加炎症免疫刺激和诱导高尔基体应激的能力[12]，从而能促进肿瘤的迁移。而Aikaterini 等[13-14]研究显示，透明质酸酶2(Hyal-2)低表达同时透明质酸合成酶（HAS1 和HAS2）表达增高，导致产生高分子量透明质酸（high molecular weight hyaluronan，HMWHA）并在HT1080 细胞的周围基质中沉积蓄积，结果HT1080 细胞迁移能力显著降低，同时外源性HMWHA 显著抑制HT1080细胞的迁移，当加入透明质酸酶后，HT1080 细胞运动性显著增加。外源性透明质酸会促进透明质酸合成酶高表达[15]，促进内源性HA 合成作用，使机体合成HMWHA。本研究建立裸鼠原位种植瘤转移模型，结果HA 组结肠癌的肝转移率在体内低于模型组（P＜0.05）。HA 在体内能抑制肿瘤的转移，可能与外源性HA 能促使机体合成HMWHA 有关。

本研究的主要目的是探讨HA 是否会对腹部和盆腔肿瘤患者产生不良影响。结果表明，外源性HA 未见对上述肿瘤的增殖有促进作用，在转移模型中HA 表现出一定的抑制肿瘤迁移的作用，符合HA 在肿瘤患者中应用的要求,但其机制还需进一步研究。