2017-2018年陕西省H7N9禽流感病毒流行特征及基因进化分析

史 伟,李 慎,吴 瑞,张俊君,李 俊,高 涛,焦亚东,张 蕾,徐 艺,张少白,余鹏博

2013年长三角地区的上海市和安徽省先后报告H7N9流感病毒引起的人间感染病例，这也是全球首次报道的人类感染该亚型的流感病毒[1]。截至2017年4月，全球共报告1 344例人感染H7N9流感确诊病例，其中死亡511人[2]。迄今为止，陕西省共报告7例人感染H7N9流感病例和2起禽间H7N9疫情。其中2017年5月，咸阳市一例重症肺炎病例在西安被确诊为H7N9病例，为陕西省首例H7N9流感病毒导致的人类感染病例[3]，此后又发现6例人感染病例[4]。

为评估H7N9流感病毒暴露风险，为防控工作提供科学依据，本研究对2017年5月至2018年3月陕西省H7N9流行分布和基因特性进行整理和分析。

1 材料与方法

1.1样本采集 陕西省在每个地市均设有监测点，长年开展外环境禽流感病原学监测任务[5]。采样方法参考《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案(2011版)》[6]的要求，采集禽类粪便、禽类饮水、禽笼具表面擦拭等类型环境标本。

H7N9报告病例检测及禽间疫情暴露环境监测：按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案(第3版)》[7]和《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》[8]进行样本采集和流行病学调查。

1.2病毒检测与毒株分离 待检样本暂存于4 ℃并于24 h内送至当地流感网络实验室。核酸提取采用凯杰公司QIAamp Viral RNA Mini Kit (Cat No.52904)提取。所有样本先开展甲型流感初筛，阳性样本再进行H7亚型检测。流感分型试剂由江苏硕世生产。国家流感中心对阳性样本进行复核和鸡胚毒株分离，并对毒株利用Illumina平台进行全基因组测序；PCR核酸检测阳性但未分离出鸡胚株的环境样本直接进行测序[9]。测序结果上传至中国流感病毒基因序列数据库。

1.3病毒序列分析 采用MEGA X软件[10]对核苷酸推导出的氨基酸序列进行位点变异比对并构建遗传进化树，进化树采用Neighboring-joining法进行绘制，Bootstrap重复值为1000。导出结果用FigTree进行美化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree)。参考毒株的基因序列来自GISAID(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，全球共享禽流感数据倡议组织数据库)。

2 结 果

2.12017-2018年外环境H7N9病原监测情况 2017年5月至2018年3月，陕西省142个监测点共采集活禽市场外环境标本2 442份，检出H7N9阳性标本12份，阳性率为4.91‰。

2.2H7N9报告病例及暴露环境监测情况 陕西省共发现H7N9病例7例，其中包括：咸阳[3]和榆林的两起聚集性病例，以及西安和宝鸡报告的散发病例。其中5例发病前有活禽接触史。

对所有本地病例暴露环境进行环境监测发现：咸阳采集环境样本192份，结果均为阴性；西安采集环境样本209份，H7N9阳性样本11份；宝鸡采集各类环境样70份，H7N9阳性样本3份。

另外，根据世界动物卫生组织报告，陕西省榆林市[11]和铜川市各发现1起禽间禽流感疫情。其中榆林市报告家禽死亡约2.2万只，铜川市死亡蛋鸡810只。具体信息和地理分布情况分别见表1和图1。

表1 2017年至2018年陕西省H7N9标本基本信息及检测结果Tab.1 Informations and results of specimens from Shaanxi Province from 2017 to 2018

注：*和**为聚集病例

注：图例中鸡/人(红)代表感染高致病性H7N9，鸡/人(黑)代表感染低致病性H7N9；鸡头向右代表样本来自规模化养殖场，向左代表样本来自活禽市场图1 2017-2018年陕西省H7N9病毒变异株分布情况Fig.1 Distribution of H7N9 virus mutants in Shaanxi Province from 2017 to 2018

2.3陕西省H7N9流感病毒HA和NA核苷酸序列同源性分析 选择A/Anhui/2013和A/Guangdong/17SF062/2017、H7N9重组疫苗株A/duck/Fujian/S4170/2014为参考株，运用MEGA X对上述14株病毒HA基因和NA基因同源性进行分析。陕西省分离的H7N9 HA基因核苷酸的同源性分别为99.17%～99.29%、99.28%～99.89%和96.44%～96.58%；NA基因核苷酸与上述H7N9流感病毒代表株的核苷酸的同源性为99.09%～99.24%、98.51%～98.67%、95.89%～96.27%。

2.4H7N9流感病毒种系进化树分析 宝鸡、榆林、西安、铜川分离毒株HA氨基酸发生插入突变为PEVPKRKRTAR↓GLF，咸阳、西安、宝鸡为PEIPKGR↓GLF。据报道，长江三角洲地区是公认的原始来源地，珠三角地区作为H7N9的额外暴发源[12]。从进化上将H7N9分为长江三角洲分支(Yangtze River Delta)和珠江三角洲分支(Pearl River Delta)，而陕西省分离到的毒株均属于长江三角洲分支。陕西省所发现的H7N9高致病株HA序列与2016年底在广东最早发现的高致病株高度同源，见图2左图所示。NA遗传进化特点与HA一致，即陕西高致病性H7N9变异株与广东2016高致病株NA基因高度同源。见图2右图所示。

图2 2017-2018年陕西省H7N9流感病毒HA(左)和NA(右)进化树Fig.2 Phylogenetic trees for HA (left)and NA(right) genes of the influenza H7N9 viruses in Shaanxi Province

2.5H7N9陕西株编码蛋白关键氨基酸位点分析 结合表1信息和所有毒株核酸序列信息，对H7N9关键氨基酸位点发现：宝鸡、榆林、西安、铜川分离毒株HA氨基酸发生插入突变为PEVPKRKRTAR↓GLF，系高致病性H7N9流感病毒(High Pathogenic，HP)；咸阳、西安、宝鸡为PEIPKGR↓GLF，系低致病性H7N9流感病毒(Low Pathogenic，LP)。部分病毒HA蛋白出现Q226L改变，提示这几株病毒具有结合人类和禽类的双受体结合特性。3株毒株PB2蛋白分别出现E627V或E627K改变，提示病毒发生与毒力增强相关的突变[13-15]。所有毒株PB1蛋白473V改变，提示在哺乳动物中的复制能力增强[16]；M1蛋白30和215位点均发生与毒力增强相关的突变[17]；M2蛋白S31N改变，提示所有毒株对烷胺类药物耐药[18]；NS1蛋白中80-84位点氨基酸未发生缺失[19]。详见表2。

表2 2017年至2018年陕西省H7N9标本基本信息及检测结果Tab.2 Information and results of specimens from Shaanxi Province from 2017 to 2018

3 讨 论

人感染H7N9流感病毒是2013年首次被发现[1]，在之后数年在我国安徽、上海、浙江、福建、广东等多省均有报道[2, 20]。陕西作为内陆省份，外环境一直未监测到[5]。直到2017年5月才报道首例人感染H7N9病例[3]。据报道，陕西省多个县区开展活禽养殖业务[21]，人群暴露在病毒环境下的可能性较高。因此，评估人群暴露风险、研究本省H7N9禽流感病毒的分子特征至关重要。

2017年5月至2018年3月，陕西省142个活禽市场监测点H7N9核酸阳性率为4.91‰，提示陕西省活禽市场整体污染状况较低。但从H7N9病例追溯其接触的活禽市场中环境样本有病毒检出，提示从业人员应注意禽流感暴露的风险。

从进化来分析陕西14株H7N9流感病毒基因信息。它们与长三角地区的H7N9高度同源，但却又分成低致病性和高致病性两个分支，也反映了病毒来源的复杂性。这可能和两方面原因有关：一方面陕西有丰富的自然资源，适宜鸟类的生存与迁徙[22-23]；另一方面，陕西地处交通要道，周边省份发现H7N9病例后关闭活禽市场[24]，病禽很可能流通到本地。

编码蛋白关键氨基酸位点序列分析发现：H7N9裂解位点的突变导致其对家禽致病力增强，给活禽养殖业带来巨大威胁。同时，HA蛋白Q226L突变增加了病毒对人α-2,6唾液酸受体结合力增强；PB1蛋白473V改变、PB2蛋白E627V/K改变、M1蛋白30D和215A均提示病毒致病力和对哺乳动物的适应性在增强。M蛋白均发生S31N突变，提醒我们在临床诊疗中选择针对性的药物[25]。

因此，为更好的防控H7N9流感，需要加强人H7N9流感疫情的检测并密切关注病毒变异情况。规范活禽市场管理，加强禽类H7N9流感病毒的监测和控制。

利益冲突：无

引用本文格式：史伟，李慎，吴瑞，等.2017-2018年陕西省H7N9禽流感病毒流行特征及基因进化分析[J].中国人兽共患病学报，2020，36(2)：124-129. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.014