固定化细胞提高热带假丝酵母菌的噻吩耐受性及降解效率

傅悦，张雪晴，李飞，刘安，张朝正

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

汽车尾气排放是空气中PM2.5颗粒物的重要来源之一，而汽车尾气中的SOx可引起尾气处理系统的催化剂中毒，会进一步加重尾气中污染物的排放[1]。因此，脱除燃油中的含硫化合物是减少汽车尾气污染物排放的重要途径。汽油中含硫化合物的种类很多，主要有硫醇、硫醚、噻吩、甲基噻吩等。我国汽油中噻吩及其衍生物所含硫约占汽油中总硫含量的83%[2]，所以脱除噻吩是提高我国汽油品质的关键，在我国汽油的脱硫研究中应选取噻吩作为模式化合物。噻吩及其衍生物是石油中的主要含硫化合物，也是人们重点研究的含硫化合物[3-4]。噻吩环上硫原子的电子云密度由大到小依次为二苯并噻吩>苯并噻吩>二甲基噻吩>甲基噻吩>噻吩，电子云密度越小越不容易氧化，而噻吩是电子云密度最低的，也是最难于降解的[5]，所以噻吩的降解是实现油品深度脱硫的关键所在。微生物脱硫具有成本低廉、无二次污染的特点，已经成为降解有机硫的主要手段[6-9]。

固定化技术是提高菌体浓度和减少细胞伤害的有效方法[10-12]。Li等[13-14]分离得到一株Mycobacterium goodie X7B，发现：利用固定化细胞技术，在24 h后，使模拟汽油中总硫从227 μg/g降到71 μg/g；在两步连续反应后，使汽油中总硫降到54 μg/g。Dinamarca等[15-16]把Rhodococcusrhodochrous固定在硅胶上，然后置于生物反应器中循环操作,他们发现在大粒径硅胶和较长填充高度下，脱硫效率达到84%。这些研究表明，固定化技术可降低有机物对细胞的毒性，在增加细胞浓度的同时，也提高了细胞的活性。

在前期的研究中，本课题组利用自行开发的电场辅助筛选装置[17]筛选得到了一株降解噻吩的热带假丝酵母菌，但是在培养过程中发现该菌株对噻吩的耐受度低[18]。本工作采取固定化细胞的方法，以解决噻吩对菌体的毒性问题。采用海藻酸钠包埋的方法固定化菌体细胞，优化了固定化的方法和条件。然后将固定化的细胞用于降解水相中的噻吩，考察了固定化热带假丝酵母菌降解噻吩的实验条件，为固定化热带假丝酵母菌用于汽油中噻吩的降解研究提供了技术支撑。

1 实 验

1.1 菌 种

实验所用菌株为热带假丝酵母菌TCCC 30004，天津科技大学微生物菌种保藏管理中心保存。

1.2 主要试剂

无水氯化钙，天津市化学试剂供销公司；海藻酸钠、无水葡萄糖，天津市福晨化学试剂厂；噻吩、蛋白胨、氯化钠，天津市北方天医化学试剂厂；酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；无水乙醇，天津市化学试剂一厂；色谱甲醇，天津市康科德公司；除色谱甲醇外其他试剂均为生化试剂或者分析纯试剂。

1.3 培养基

YEPD培养基：酵母粉1 g/100 mL、蛋白胨2 g/100 mL、无水葡萄糖2 g/100 mL，pH 7.0，121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min，接种前加入5 mL/100 mL噻吩-乙醇溶液(噻吩-乙醇溶液：1 mL噻吩溶于100 mL无水乙醇中)，噻吩终质量浓度为500 mg/L。制备固体培养基时，需另加2%琼脂。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞固定化

配置固定化载体溶液：将不同配比的海藻酸钠和聚乙烯醇，加热溶解至均一胶状液体，静置降至室温，备用。

将保藏在斜面上的热带假丝酵母菌转接到固体斜面培养基上，30 ℃恒温培养过夜，进行活化；从活化的斜面培养基中挑一环酵母菌转接入灭菌的YEPD液体培养基，置于180 r/min摇床中，30 ℃下培养12 h；将培养液中的菌液以5%的接种量转接到100 mL新鲜的YEPD培养基中，30 ℃、180 r/min下培养12 h，得到处于对数生长期的热带假丝酵母菌细胞；取100 μL培养液菌落计数，剩余培养液在4 ℃，5 000 r/min条件下离心收集菌体。

将离心收集到的菌体用少量生理盐水溶解，倒入10 mL包埋液溶液中搅拌均匀。用注射器吸取包埋液与菌体的混合液，逐滴滴入0.1 mol/L氯化钙溶液中，室温下钙化2 h，置于4 ℃过夜，形成固定化细胞微球(每个微球约0.2 g)，置于生理盐水中4 ℃冷藏备用。微球内的菌落数以培养液的菌落计数结果计算平均值约为5×1010个/g微球。

1.4.2 固定化微球性质的表征

将微球从生理盐水溶液中取出，用超纯水洗涤微球3次，将洗净的微球置于-80 ℃冰箱中冷冻5 h以上。然后将冻硬的微球置于冷冻干燥机中冻干。取冻干的微球，把其中的部分样品切开，以便于观察微球内部状态。样品喷金后，使用扫描电镜(FEI Apreo HIVac,Czech，捷克)观察微球表面和内部的菌体情况。

2 结果与讨论

2.1 固定化细胞材料的确定

实验中选取向海藻酸钠中添加聚乙烯醇作为固定化材料[19]。向海藻酸钠中添加聚乙烯醇是为了增大固定化微球的孔隙，以便于微球内菌体和外界环境中的物质交换。但是在实际操作中发现，向海藻酸钠中添加聚乙烯醇会使固定液中产生很多气泡，制备的微球孔隙较大，在固定化微球的过程中，细胞容易游离出微球，电镜观察时只观察到少量细胞。而只有2%海藻酸钠制备的微球表面和内部均能看到大量的酵母细胞(图1)，而且微球表面形成了一层紧密的薄膜，将细胞包裹在微球里，使细胞不能脱离(图1a)。固定化微球的内部结构致密，菌体量也很丰富，固定化效率很高(图1b)，证明固定化实验是成功的。固定化热带假丝酵母所具有的明显优势是由于固定化材料保护菌体不受高浓度底物的毒害，且在溶液中具有较高的菌体密度。

图1 固定化微球表面(a)和内部(b)电子扫描电镜照片

2.2 接种量的确定

把制好的微球用无菌水冲洗后，接种到初始pH=7.0含有噻吩的YEPD液体培养基中，选择不同的接种量于30 ℃、120 r/min摇床培养24 h，平行样品3个，采用高效液相色谱检测噻吩含量，计算噻吩的降解率[20]，结果见图2。

图2 不同接种量下噻吩的降解率

由图2可知，较佳的接种量为7 g/100 mL。噻吩的降解率随着接种量的增加呈先增大后平稳的趋势，当接种量达到7 g/100 mL时，接种菌体密度达3.5×109/mL。接种量引起的降解率的变化是和菌体的量和培养基中的营养物质传递相关的，降解率会随着培养液中菌体密度增加而增加，但是当培养液中的营养物质不能满足大量的菌体的需求时，降解率趋于平衡。

2.3 培养基初始pH值的确定

配置不同初始pH值的培养基，灭菌后按照7 g/100 mL的接种量接入固定化微球，在30 ℃，120 r/min条件下，发酵培养24 h后，检测噻吩的降解情况，结果见图3。

由图3 可知，在当培养基初始pH值在8.5～9.0之间时噻吩的降解率最大。这主要是由于噻吩是酸性物质在碱性条件下更容易成盐，有利于传导进微球内部，从而增加降解率。

图3 不同初始pH值下的降解率

2.4 培养温度的确定

培养温度是菌株活性非常重要的因素，由于该菌株在游离状态下的培养温度在30 ℃时最佳[11]，因此在考察固定化后的培养温度时选取了25、30、35 ℃进行培养操作，考察在3个温度下的固定化细胞对噻吩的降解率，结果见图4。由图4可知，固定化细胞后，热带假丝酵母菌的最适降解温度并为改变，依然为30 ℃，也说明海藻酸盐作为固定化载体对热带假丝酵母菌的培养温度并无明显影响。

图4 温度对降解率的影响

2.5 降解时间的确定

在确定的降解条件下，将固定化微球接种到培养基中，在30 ℃、120 r/min的条件下摇床培养24 h，取样时间间隔4 h，分析在不同降解时间下固定化热带假丝酵母对噻吩的降解效率，确定最佳降解时间。

配置液体培养基，调节初始pH值为8.5～9.0，在30 ℃、120 r/min条件下，摇床培养，分别在不同时间取样，分析噻吩含量，设立平行实验3份，空白1份。由于取样涉及到过夜，将实验分成两个阶段进行,即0～16 h为第一阶段，12～24 h为第二阶段。降解率结果见图5。由图5可知，降解率随着时间的增加一直在增加，当16 h以后降解率增加变缓慢，16～24 h之间几乎没增加，因此选择降解操作的时间为16 h，降解率达62.3%。降解效率高的主要原因是由于固定化细胞使相对细胞浓度增加，从而加快了噻吩的降解。

图5 降解效率和降解时间之间的关系

3 结 论

a.热带假丝酵母菌可以包埋在2%海藻酸钠中，且微球表面坚韧紧密，菌体难以游离出微球。扫描电镜照片显示微球内菌体含量丰富，包埋效果良好。将固定化微球接种到含噻吩的培养基中，微球内部菌体可有效降解高浓度噻吩，解决了热带假丝酵母在高浓度噻吩条件下没有降解活性的难题。

b.固定化细胞技术的应用不仅提高了培养液中的细胞浓度，而且增加菌株的耐受性，提高了降解效率。噻吩初始浓度500 mg/L时降解效率依然不低于60%。前期研究中噻吩初始浓度2.2 mg/L时降解效率达到99.6%[20]，噻吩初始浓度为100 mg/L时降解效率达到66%[18]，但是当初始噻吩浓度高于100 mg/L时降解效率均非常低。固定化细胞技术解决了细胞对有机物的耐受性低的问题，同时提高了菌体密度，为固定化技术在汽油脱硫中的进一步应用打下了基础。