Menaquinone－7 对大鼠血管钙化的抑制作用

李飞， 徐峰， 陈侠

（沈阳药科大学生命科学与生物制药学院生理学教研室， 辽宁 沈阳110016）

血管钙化是钙离子在血管壁上过量沉积的结果， 治疗不及时则会引发各种心血管疾病。 然而，临床上针对血管钙化的治疗主要是缓解症状， 仍然缺乏有效的治疗手段。 近年来， 一些研究证明维生素K 能够抑制血管钙化及心血管疾病的发生和发展［1－2］。 维生素K 作为γ－谷氨酸羧化酶（γglutamate carboxylase， GGCX） 的辅酶参与蛋白质中谷氨酸残基的羧化过程， 并且因此参与调节钙离子在体内各组织的沉积过程。 维生素K2 是维生素K 在体内发生作用的重要形式， 外源性摄入维生素K2 可显著降低冠心病的发病率， 而给予维生素K1 对心血管发病率无显著影响［3－4］。 因此， 维生素K2 对心血管健康的保护作用得到人们更多的关注。 Menaquinone－7 （MK－7） 是具有较长半衰期的长链维生素K2， 大量存在于大豆发酵制品纳豆之中。 它具有吸收率高［5］、 生物活性强等优点，对骨质疏松及血管钙化都显示出较强的抑制作用［6－7］。 然而， MK－7 对骨钙代谢异常导致的血管钙化的改善作用尚不明确。 我们的前期研究表明MK－7 对糖皮质激素诱导的骨质疏松及钙代谢异常有显著的抑制作用。 本研究将考察MK－7 对糖皮质激素性骨钙代谢异常引起的大鼠血管钙化的抑制作用及作用机制， 为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3 月龄SD 大鼠， SPF 级， 100只， 雌雄各半， 体重（200 ± 20） g， 由辽宁长生生物技术有限公司提供， 实验动物许可证号：SCXK （辽） 2015－0001。 大鼠分笼饲养， 自由摄食饮水， 室温恒定（22±2）℃， 适应性喂养10 d后进行实验。

1.2 药品与试剂 MK－7 （广东双骏生物科技有限公司）， 地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司）， 食用油（中粮北海粮油工业有限公司）， Menaquinone－4 （MK－4， 上海贺普实业有限公司）， 生长停滞特异性基因产物6 （growth arrest specific gene 6， Gas 6） 多克隆抗体（美国Proteintech 公 司）， 护 骨 素 （ osteoprotegerin，OPG）、 骨桥蛋白（osteopontin， OPN）、 钙结合蛋白（calcium－binding protein， CaBP）、 骨形态发生蛋白－7 （bone morphogenetic protein－7， BMP－7）、血栓素B2 （thromboxane B2， TXB2）、 前列腺素E2 （prostaglandin E2， PGE2） 及6－酮－前列腺素F1α （6－keto－prostaglandin F1α， 6－keto－PGF1α）放射免疫试剂盒（北京华英生物技术研究所）。

1.3 仪器 高速冷冻离心机（科大创新股份有限公 司， 型 号： HC － 3018R）， 多 功 能 酶 标 仪（THERMO scientific， 型号： Mx3000P）， 全自动生化分析仪（宁波美康生物科技有限公司， 型号：MS－880）， 全自动放免计数仪（西安核仪器厂，型号： XH－6020）。

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组与给药 大鼠按体重随机分为正常对照组（10 只） 和地塞米松注射组（90只）。 地塞米松注射组大鼠肌内注射地塞米松2.5 mg／kg， 每周3 次， 正常对照组肌内注射相应容量的生理盐水。 连续注射6 周后， 停止注射。大鼠禁食24 h， 眼眶静脉取血， 分离血清， 使用全自动生化分析仪测定大鼠血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP） 水平， 将地塞米松注射组大鼠的ALP 水平与正常对照组大鼠的ALP 水平进行比较， 评定造模结果。 将造模成功的大鼠随机分为5 组： 模型组、 阳性对照组（MK－4，104 μg／kg）、 MK－7 6.5、 26、 104 μg／kg 剂量组。正常对照组和模型组按10 mg／kg 食用油灌胃， MK－7 各剂量组按所设剂量给予食用油溶解的MK－7灌胃， 阳性对照组每天给予食用油溶解的MK－4（104 μg／kg） 灌胃， 每日1 次， 连续6 周。 各组大鼠分笼饲养， 自由摄食饮水， 室温恒定（22±2）℃。

1.4.2 观察指标与方法 末次给药后， 大鼠禁食24 h， 眼眶静脉取血， 分离血清， 采用放射免疫法测定 血 清OPG、 OPN、 CaBP、 BMP －7、 TXB2、PGE2 及6－keto－PGF1α 水平。 脱臼处死大鼠， 取主动脉组织约100 mg， 采用Western blot 法检测血管Gas 6 蛋白水平， 利用Image J 软件对蛋白条带进行光密度值分析。 取主动脉2 ～3 cm， 利用Von Kossa 染色法， 于光镜下观察血管中黑色深染结构为钙斑。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析， 计量资料以均数±标准差表示， 采用单因素方差分析及Dunnett－t 检验进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK－7 对血管壁钙斑形成的影响 干预6 周后， 经Von Kossa 染色， 正常对照组大鼠主动脉壁未见黑色深染结构， 模型组大鼠的主动脉壁多处呈现条状黑色深染结构， MK－7 各剂量组及MK－4组大鼠主动脉壁中条状深染结构明显少于模型组，见图1。

图1 MK－7 对大鼠血管壁钙斑形成的影响（Von Kossa 染色×400）

2.2 MK－7 对大鼠血清OPG、 OPN、 CaBP 及BMP－7 水平的影响 与对照组比较， 模型组大鼠血清OPG、 OPN、 CaBP 及BMP－7 水平明显降低；与模型组比较， MK－7 104 μg／kg 组及MK－4 组显著升高大鼠血清OPG、 CaBP 及BMP－7 水平， 差异均有统计学意义， 见图2A－C； MK－7 各剂量组对大鼠血清OPN 水平无明显作用， MK－4 组显著升高大鼠血清OPN 水平， 差异有统计学意义， 见图2D。

图2 MK－7 对大鼠血清OPG、 OPN、 CaBP 及BMP－7 水平的影响（n＝10）

2.3 MK－7 对大鼠血管Gas 6 蛋白水平的影响 与对照组比较， 模型组大鼠血管Gas 6 蛋白水平显著降低； 与模型组比较， MK－7 104 μg／kg 组及MK－4 组可显著升高Gas 6 的蛋白水平， 差异均有统计学意义， 见图3。

图3 MK－7 对大鼠血管Gas 6 蛋白水平的影响

2.4 MK－7 对大鼠血清TXB2、 PGE2 及6－keto－PGF1α 的影响 与对照组比较， 模型组大鼠血清TXB2 明显升高， PGE2 及6－keto－PGF1α 水平显著降低； 与模型组比较， 各剂量MK－7 可显著降低大鼠血清TXB2 水平， 显著升高大鼠血清PGE2及6－keto－PGF1α 水平， MK－4 显著升高大鼠血清PGE2 及6－keto－PGF1α 水平， 差异均有统计学意义， 见图4。

3 讨论

血管钙化是钙离子在血管壁上过量沉积的结果， 在血管病变中， 动脉钙化的出现往往预示着临床上不良的心血管事件。 现有研究表明， 维生素K2 不仅能够促进骨钙沉积， 在预防和治疗血管钙化方面也发挥重要的作用［8－9］。 本研究结果显示， 大鼠注射地塞米松后， 其主动脉管壁上可检测到黑色深染的条状钙化斑块， 提示地塞米松促进大鼠血管壁的钙盐沉积。 MK－7 大鼠主动脉壁中条状深染结构明显少于模型组， 提示MK－7 能够抑制钙盐在血管壁上的沉积， 减少血管壁中钙斑的形成。

图4 MK－7 对大鼠血清TXB2、 PGE2 及6－keto－PGF1α 的影响

Gas 6 是维生素K 依赖蛋白家族成员之一， 在生物体内广泛分布， 而血管平滑肌是Gas 6 的高表达区域。 发生血管钙化的组织中， Gas 6 蛋白的表达量低于正常血管组织［10］。 在本实验中， 发生血管钙化大鼠主动脉血管中Gas 6 的蛋白水平显著降低， 而高剂量MK－7 可显著提升主动脉Gas 6 蛋白水平。 Gas 6 蛋白可抑制单核／巨噬细胞释放炎症因子（如TNF－α、 IL－1 及IL－6）［11］， 从而调控炎症反应。 近年来还发现Gas 6 具有抗凋亡作用， 可通过Gas6／Axl／Akt 信号通路抑制血管平滑肌细胞的凋亡［12］。 以上结果提示， Gas 6 介导MK－7 对血管钙化的抑制作用， 可通过抑制炎症反应及凋亡来抑制地塞米松诱导的动脉钙化。 OPG、 BMP－7等钙代谢相关蛋白是重要的血管钙化抑制因素［13－14］， 高剂量MK－7 能够显著提高血清OPG、CaBP 及BMP－7 的水平。 MK－7 抑制血管钙化的作用可能与其上调上述血管钙化抑制蛋白的水平有关。

PGE2 是花生四烯酸环氧合酶代谢产物， 具有扩张血管、 免疫抑制和抗炎作用， 可以剂量依赖性地抑制高磷诱导的血管钙化及由此引发的心血管不良事件［15］。 MK－7 显著升高血清PGE2 水平，进而抑制血管钙化。 血栓素A2 （thromboxane A2，TXA2） 和前列环素（Epoprostenol， PGI2） 是花生四烯酸代谢的中间产物， PGI2 扩张血管， 抑制血小板聚集； 而TXA2 收缩血管， 促进血小板聚集。在正常生理状态下， TXA2 与PGI2 处于相对平衡状态， 这是维持血液通畅的重要因素之一。 TXA2水平升高或者PGI2 水平降低， 会导致血管痉挛和血小板聚集性增强等一系列变化， 是促进动脉硬化及血栓性疾病发生的重要原因［16］。 由于TXA2与PGI2 性质都极不稳定， 不易检测， 而其代谢产物TXB2 和6－keto－PGF1α 则相当稳定， 因此可通过测定TXB2 和6－keto－PGF1α 反映TXA2 和PGI2的水平。 本研究显示， MK－7 显著降低大鼠血清TXB2 水平， 升高血清6－keto－PGF1α 水平。 表明MK－7 作用后， 大鼠血清TXA2 水平降低， PGI2水平升高， 有助于改善微循环， 抑制血管钙化。

综上所述， MK－7 可通过上调Gas 6、 OPG、BMP－7 等血管钙化抑制蛋白的水平进而抑制血管钙化； 另一方面， MK－7 可以抑制TXB2 的形成，促进PGE2 及6－keto－PGF1α 的形成， 有助于抑制血管钙化。