蜡状芽孢杆菌协同李氏禾根系分泌物去除水体Cr6+的效应及机制

2020-04-11林华林志毅满向甜KongCHHUON刘杰俞果

生态环境学报 2020年2期

林华，林志毅，满向甜，Kong-CHHUON，刘杰，俞果*

1. 桂林理工大学/广西环境污染控制理论与技术重点实验室，广西桂林 541004；2. 桂林理工大学岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，广西桂林 541004；3. 柬埔寨理工学院，柬埔寨金边 120000

根系分泌物是植物生长过程中分泌并释放到根际环境中的有机化合物的总称，目前已知的根系分泌物种类有200种左右，包括氨基酸、有机酸、酶、可溶性糖等（Boeuf-Tremblay et al.，1994；Baetz et al.，2014）。这些根系分泌物是植物与土壤环境进行物质和能量交换的载体，对根际土壤的理化性质有重要的影响（Haichar et al.，2014；Bertin et al.，2003）。近年来，随着高效液相色谱、气相色谱等分析技术的研发和应用，世界各国科研人员在环境污染防治、土壤学等领域对根系分泌物开展了广泛的研究。研究表明，根系分泌物可以改善土壤质量、提高植物抗性，在土壤修复尤其是在土壤重金属污染的植物修复领域发挥着巨大的作用。王艳红等（2008）发现锌（Zn）超富集植物东南景天（Sedum alfrediiHance）的根系分泌物能活化土壤中难溶态的 ZnO、ZnCO3等。卢豪良等（2007）发现秋茄（Kandelia candelL.）的根系分泌物能有效提高沉积物中重金属（Cu、Pb、Cd、Zn）的生物有效性。

铬（Cr）是一种危害性大的环境污染物，其对生物体具有明显的致癌和致畸作用，因此铬污染被世界各国列为重点防治对象（Miretzky et al.，2010；Wise et al.，2014）。李氏禾（Leersia hexandraSwartz）是中国首次发现和唯一报道的湿生铬超富集植物，对Cr6+具有很强的吸收和富集能力，在铬污染水体的植物修复方面表现出巨大的潜力（Zhang et al.，2007）。近几年来，关于李氏禾超富集铬的研究取得了不少进展，但是还有一些问题仍需深入研究：如李氏禾如何通过根系分泌作用适应铬胁迫，其根系分泌物与根际微生物的协同作用等（Liu et al.，2009；Liu et al.，2011；Zhang et al.，2009）。伍婵翠等（2016）发现李氏禾根系分泌物对土壤中难溶性铬具有较强的活化作用。我们的前期实验结果表明，李氏禾根际存在较高丰度的蜡状芽孢杆菌，而蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种耐高浓度铬胁迫的微生物，这意味着在李氏禾耐受和富集Cr6+的过程中蜡状芽孢杆菌可能起到了重要的作用。

本研究在水培条件下，研究添加外源蜡状芽孢杆菌与李氏禾的根系分泌物共同净化水体Cr6+的影响，并利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）研究Cr6+胁迫和添加外源蜡状芽孢杆菌对李氏禾根系分泌物组成成分的影响，以明确根系分泌物在李氏禾还原Cr6+过程中的作用，进一步丰富李氏禾超富集铬的生理机制，为提高李氏禾修复Cr6+污染水体效率提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试李氏禾采自于广西桂林市雁山镇周边未受重金属污染的田埂间，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）购自中国典型培养物菌种保藏中心（菌种编号CCTCCAB2011085），菌株接种于液体培养基中扩大培养12 h后，4000 r·min-1离心10 min，弃上清液，离心后的菌体添加适量无菌水调节菌体浓度为108cfu·mL-1的菌悬浮液备用。

1.2 植物的预培养

选取生长一致的李氏禾幼苗，用去离子水洗净，分别栽入含有1.5 L体积分数为50%的Hoagland营养液的塑料盆中，塑料盆容积为 2 L，在人工气候室中预培养7 d，每3 d更换一次营养液。人工气候室培养条件设置：光照16 h，温度25 ℃，光照强度7000 Lx，相对湿度75%。

1.3 根系分泌物与蜡状芽孢杆菌相互作用对 Cr6+还原实验设计

为保证实验过程中根系分泌物成分不变，取预培养中李氏禾的原水培液100 mL，置于250 mL锥形瓶中进行实验，向每一组的锥形瓶中添加适量Cr6+（K2Cr2O7）溶液使初始质量浓度为 10 mg·L-1。以不添加蜡状芽孢杆菌和李氏禾根系分泌物作为空白组，另外四组实验处理分别添加：活菌、根系分泌物、根系分泌物+活菌、根系分泌物+灭活菌。实验使用的活菌为 1.1中制备的 108cfu·mL-1蜡状芽胞杆菌悬浮液；灭活菌采用扩大培养后的蜡状芽胞杆菌经高压蒸汽120 ℃，灭活20 min；将锥形瓶放入恒温摇床振荡培养，培养条件为 30 ℃、160 rmp，每隔2 h对锥形瓶中溶液进行取样，测定溶液中Cr6+含量，测试方法为二苯碳酰二肼分光光度法（赖永忠，2019）。对于含有蜡状芽胞杆菌的3个处理组（活菌、根系分泌物+活菌、根系分泌物+灭活菌），同时测细菌溶液在波长600 nm处的吸光度，利用细菌的吸光值来反应细菌菌体细胞密度，从而了解细菌的生长情况，绘制细菌生长曲线。

1.4 根系分泌物的收集实验设计和分析测定方法

取预培养好之后生长一致的李氏禾幼苗，用去离子水反复清洗，分别移植20—30株李氏禾到备好的塑料盆中，塑料盆中的李氏禾设置3组处理：（1）用质量浓度10 mg·L-1Cr6+（K2Cr2O7）溶液胁迫李氏禾；（2）在 10 mg·L-1Cr6+（K2Cr2O7）铬胁迫下向培养液加入一定量 108cfu·mL-1的蜡状芽孢杆菌悬浮液；（3）只用去离子水培养李氏禾作为对照组（即培养的李氏禾不加铬）。使用通气泵每天给李氏禾的培养液中通气3 h（早中晚各1 h），培养10 d后收集李氏禾根系分泌物，操作如下：将培养10 d的李氏禾取出并用去离子水反复冲洗，在新制备的超纯水中加入 3滴体积分数 0.05%的百里酚溶液，浸泡李氏禾根部 5 min。然后将李氏禾放入 0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液中，放置于光照培养箱中培养24 h，之后收集含有根系分泌物的溶液，过0.45 μm滤膜，用真空旋转蒸发仪（40 ℃，90 r·min-1）浓缩至20 mL冷冻干燥，用去离子水定容至2 mL，转移至GC进样小瓶，在4 ℃冰箱冷藏，供GC-MS分析。

GC测试条件：美国 PerkinElmer气相色谱-质谱联用仪（Claus 680 GC；600T MS）；Elite-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱；色谱柱升温程序：初始温度50 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升温至250 ℃并保持15 min；进样口温度；载气：纯度为99.999%的氦气，载气流速1 mL·min-1；进样方式：分流进样，进样量l μL。

MS分析条件：EI离子源，电离电压70 eV；质谱扫描方式：全扫描，扫描范围为50—800 amu；离子源温度200 ℃；接口温度25 ℃；检测电压1 kv；溶剂延迟时间3 min。

1.5 数据处理

本研究采用Excel 2010、Origin 8.5和SPSS 18.0进行统计分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌联合作用下净化水中Cr6+的效果

图1 不同外源条件对水中Cr6+还原率的影响Fig. 1 Effect of different exogenous conditions on the reduction rate of Cr6+ in the water

图2 根系分泌物对蜡状芽胞杆菌生长量的影响Fig. 2 Effect of root exudates on the growth of Bacillus cereus

由图1可知，随着培养时间的延长，溶液中Cr6+的还原率也逐渐升高，最终趋于稳定。对比空白组，李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌活菌联合作用对Cr6+的还原效果最为明显（P＜0.05），在第10小时还原率达到75%，在24 h时还原率高达99%。李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌灭活菌联合作用下，前8 h溶液中Cr6+的还原率稳定在20%作用，在第 8小时时 Cr6+还原率增加到 60%，并在第22小时趋于稳定，达到88%。蜡状芽孢杆菌活菌单独作用对溶液中 Cr6+的还原作用明显低于前两组（P＜0.05），还原率在第 22小时时达到 58%并趋于稳定。李氏禾根系分泌物处理组中Cr6+的还原率稳定在23%左右，显著高于空白组（P＜0.05）。实验结果表明，加入适量浓度的蜡状芽孢杆菌菌液，与李氏禾根系分泌物共同作用，使溶液中Cr6+的还原率明显增加。此外，高温蒸汽灭活可能不能完全杀死菌液中的蜡状芽孢杆菌，导致李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌灭活菌联合处理组经过一段时间后对Cr6+还原率也基本达到了李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌活菌联合处理组的水平。李氏禾根系分泌物能为蜡状芽孢杆菌提供必要的营养条件，增强其代谢能力，促进了蜡状芽孢杆菌对水体中的Cr6+的还原，可以通过对根系分泌物对的成分分析进一步验证。前人研究表明，蜡状芽孢杆菌不但能够依靠自身的胞外分泌物还原Cr6+，其细胞壁也可以还原Cr6+，并固定在自身表面（Chen et al.，2012）。同时，植物根系分泌物中的烯烃、酸、醇、酚、醛也能够还原Cr6+（林琦等，2003）。实验结果表明，充分发挥李氏禾根系分泌物与蜡状芽孢杆菌还原Cr6+的协同效应，是提高 Cr6+污染水体植物修复效率的关键。

由图2可知，前4 h蜡状芽孢杆菌的光密度值都呈线性增长，添加李氏禾根系分泌物溶液中的蜡状芽孢杆菌生长情况良好，光密度值稳定在1.5左右，显著高于单独蜡状芽孢杆菌处理组（P＜0.05），说明添加李氏禾根系分泌物对于蜡状芽孢杆菌的生长具有促进作用。添加李氏禾根系分泌物溶液的蜡状芽孢杆菌灭活菌处理组光密度值同样不断增长，且在第 16小时超过其他处理组，最终稳定在2.0左右。这进一步说明蜡状芽孢杆菌在高温高压蒸汽的过程中并未完全失活。研究表明，根系分泌物中的氨基酸、烷烃等物质能为微生物提供重要的碳源、能源物质，使植物根际的微生物数量远远超过非根际，同时微生物又能促进根系的分泌作用（罗继鹏等，2018；吴林坤等，2014）。

2.2 李氏禾根系分泌物 GC-MS扫描图谱及结果分析

本文列出了在无铬、10 mg·L-1Cr6+胁迫、10 mg·L-1Cr6+胁迫条件下接种蜡状芽孢杆菌李氏禾根系分泌物的GC-MS扫描图谱。图3—5结果显示，李氏禾根系分泌物样品检测出的图谱特征峰比较显著，分布较密集，基线漂移不大，故检测结果比较可信。3种处理下扫描图谱差异明显，接种蜡状芽孢杆菌后李氏禾根系分泌物的特征峰明显少于前两种未接种情况下的根系分泌物特征峰。

图3 无铬条件下李氏禾根系分泌物GC-MS扫描图谱Fig. 3 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz without Cr stress

图4 10 mg·L-1 Cr6+胁迫下李氏禾根系分泌物GC-MS扫描图谱Fig. 4 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz with 10 mg·L-1 Cr6+ stress

图5 接种蜡状芽孢杆菌后李氏禾根系分泌物GC-MS扫描图谱Fig. 5 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz inoculated with Bacillus cereus

通过人工分析质谱图并与 NIST107质谱数据库核对分析，确定出3种处理条件下李氏禾根系分泌物的有机物质及相对含量用以进一步分析，见表1—3。

由表1和表2结果分析，无Cr6+处理和有Cr6+处理10 d后的根系分泌物分别检测出41种、47种有机化合物，都包含烷烃、酯、烯烃、芳香烃、醇、醚、酰胺。其中相对含量超过5%的物质有3种，分别是烷烃、芳香烃、酰胺。由表3分析，接种蜡状芽孢杆菌处理10 d后的根系分泌物检测出19种有机化合物，含烷烃、醇、酯、酚，相对含量超过5%的物质有烷烃、酯、酚。未接种蜡状芽孢杆菌的李氏禾根系分泌物主要成分是烷烃，芳香烃，酰胺类物质，且Cr6+胁迫下根系分泌物的种类显著增加并分泌出大量的化感物质。未接种蜡状芽孢杆菌的李氏禾根系分泌物种类未见减少，也没有特别限制某一类化合物的分泌，表明李氏禾对Cr6+具有很强的耐受能力。而接种了蜡状芽孢杆菌的李氏禾，根系分泌物有机化合物数量的减少，说明蜡状芽孢杆菌将根系分泌物作为生长代谢底物而分解掉，为自身的繁殖生长提供碳源等物质。有学者发现油菜幼苗根系分泌物成分主要包含烃、醇、酯等且烃类化合物相对含量最高（张红等，2014）。吴蕾等（2009）研究大豆、小麦、玉米、高粱的根系分泌物，发现其成分包括烷烃、酸、醇、酯、苯、酰胺、酮、醛、酚以及其他物质，与本研究得出的主要根系分泌物种类特征相似。

植物的根系分泌物成分主要受物种的基因控制，但是植物的生长环境也是因素之一，所以根系分泌物的种类和数量受植物自身生长状况和环境条件影响（罗晓蔓等，2019）。比如小麦在镉胁迫下的一些次生代谢产物的根系分泌物具有明显变化，小麦通过改变根系分泌物作用而缓解镉危害（张玲等，2002），杨瑞吉等（2006）研究发现油菜在磷胁迫下根系分泌物包括烷烃、烯烃、苯、酸、醛、酯、酮、醚等有机化合物，且在磷胁迫下，油菜根系分泌物种类增加，这都是植物通过调节根系分泌物的组成来改变根系状态以适应新的外界环境。此外，一些根系分泌物能对重金属产生吸附、络合作用，减轻重金属生物毒性。由表1、2可见，李氏禾根系分泌物中酰胺类物质前后含量的变化可能是受到铬胁迫后的一种根际解毒机制，为了证实这一点，我们还需要进一步研究李氏禾在铬胁迫下根细胞膜的受损程度，透性变化情况以及植物根际pH环境、Eh特征变化等。

表1 根系分泌物的鉴定（空白组）Table 1 Identification of root exudates (blank control group)

2.3 Cr6+胁迫下根系分泌物化感物质分泌差异

从表2、表3鉴定出来有机物的相对含量分析，李氏禾根系分泌物主要包括烷烃、芳香烃、酰胺等物质，其中不少有机化合物被报道是化感物质（Sun et al.，2019；李杨瑞，1993）。在Cr6+胁迫下，李氏禾根系分泌物中都检测到了有且仅有一种酚类物质：2, 4-二叔丁基苯酚。有学者认为苯甲酸及其衍生物、水溶性有机酸、酚类，及烷烃类等化合物都属于化感物质，对植物具有化感作用，且相对含量高的物质一般可能起主要的化感作用（Buer et al.，2010），而本文检测出的2, 4-二叔丁基苯酚是一种已经被证实具有化感效应的有机化合物（张新慧等，2008）。黄翔杰等（2017）研究野菊根系分泌物中发现2, 4-二叔丁基苯酚对生菜、莴苣、油菜有明确的化感效应，周宝利等（2010）发现对嫁接茄幼苗施加低浓度的2, 4-二叔丁基苯酚有明显的促生长作用，但是对茄子幼苗施加高浓度的2, 4-二叔丁基苯酚处理反而对生长特性具有抑制作用（王玉洁等，2007）。

表2 根系分泌物的鉴定（有Cr6+）Table 2 Identification of root exudates (under Cr stress)

表3 根系分泌物的鉴定(有微生物)Table 3 Identification of root exudates (microorganism)

本文研究发现接种蜡状芽孢杆菌与未接种相比，检测出的2, 4-二叔丁基苯酚含量更高，相对含量从0.16%升高到6.07%。Li et al.（2019）在研究蜡状芽孢杆菌 BCM2定殖番茄根系防疫根结线虫试验中，发现番茄根系分泌物中的2, 4-二叔丁基苯酚显著增加，与本研究结果一致。李氏禾根系分泌物2, 4-二叔丁基苯酚相对含量的变化是超富集植物李氏禾对重金属逆环境刺激的一种潜在响应机制。