玫瑰石斛叶片培养与原球茎诱导

许丁帆，刘艳军，通信作者，贺峰

（1.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2.魏县益聚种植园艺设计有限公司，河北 邯郸 056800）

玫瑰石斛（Dendrobium crepidatumLindl.et Paxt.）是兰科石斛属多年生草本植物，茎粗壮，肉质，味苦，以新鲜或干燥茎入药，多附生于山谷岩石或树干上，主要分布于云南、贵州两地，印度、缅甸、老挝、尼泊尔等地也有分布[1]。玫瑰石斛含有多种药用成分，具有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖等多种药用功效，是加工水草枫斗、黄草石斛的植物材料之一，且玫瑰石斛花开艳丽，具有较高的园艺观赏价值[2-3]。近年来，野生玫瑰石斛遭受到掠夺式的采挖，资源较为匮乏，有些地区甚至已到濒临灭绝的境地。

玫瑰石斛大面积人工种植的关键是解决种源问题。当前，玫瑰石斛以传统的分株和扦插等方式繁殖为主，其生产效率低，而且长此以往会导致植物病毒的积累与品种退化。利用生物技术方法对玫瑰石斛的研究也主要集中于组培试管苗的快繁和有效药用成分的分析与提取方面，对玫瑰石斛人工种子研究较少[4-5]。采用组培试管苗解决玫瑰石斛的种源问题，存在生产周期长、成本高、移栽和管理技术要求高等不足[6-9]。而利用原球茎或胚状体制作而成的人工种子，具有生产成本低、便于贮藏和运输、易于保存、适合机械化操作，可直接在土壤中萌发且发育同步化高等优点[10-11]。

苏江等利用玫瑰石斛的茎段为外植体进行了原球茎的诱导[12]。本研究采用玫瑰石斛组培苗叶片为外植体，进行原球茎的诱导与增殖研究，目的是建立和完善稳定高效的玫瑰石斛原球茎生产体系，为玫瑰石斛人工种子的研究利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中所用的玫瑰石斛组培苗由天津农学院园林植物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 玫瑰石斛原球茎的诱导试验

本研究选取玫瑰石斛组培苗叶片为外植体，诱导其产生原球茎。在超净台中，剪取带有一定量叶鞘组织的叶片，将叶片直接接种到原球茎诱导培养基上进行诱导。诱导培养基采用 MS为基础培养基，附加 30 g/L蔗糖和不同浓度配比的2,4-D、BA和NAA，采用7 g/L琼脂粉进行固化，并调节培养基pH为5.8，121 ℃下灭菌20min。用150 mL广口三角瓶为容器，加入配制好的培养基40 mL。每个处理重复10瓶，每瓶接种5个外植体。将接种后的三角瓶放到组培室中进行培养。培养条件为：首先进行避光培养，温度26 ℃，经过大约30 d后将其继代到相同的培养基上继续培养，培养条件同前面，继代培养20 d。经过2次继代培养后，待到叶片基部周围有原球茎类似物产生时，将材料转移到连续光照条件下，光照强度为2 000 lx，培养温度不变。培养结束后，统计每个处理原球茎诱导情况。

原球茎诱导率/%＝产生原球茎的外植体数/接种外植体数

1.2.2 玫瑰石斛原球茎的增殖试验

将上一步获得的玫瑰石斛原球茎从外植体上剥离下来，将其转接到已配制好的增殖培养基上。增殖培养基采用 MS为基本培养基，附加不同量的2,4-D、NAA和BA。培养基容器采用150 mL广口三角瓶，每瓶加入30 mL培养基。培养基的pH调节到5.8，蔗糖添加量为30 g/L，采用7 g/L琼脂粉进行固化，经过高温灭菌后备用。每个处理重复10瓶，每瓶接种原球茎块数为5。将接种好的材料放置在组培室中进行原球茎增殖培养。培养条件为24 h连续光照，光照强度为2 000 Lx，培养温度26 ℃。培养后每天进行试验观察，记录试验情况。经过大约30 d培养，调查试验结果并进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物激素配比对玫瑰石斛原球茎诱导的影响

由表1可知，不同诱导培养基对玫瑰石斛诱导效果差异明显。具体来看，只加入 2,4-D时，在叶片基部诱导出愈伤组织，到培养后期，未出现原球茎结构，说明2,4-D只能诱导出愈伤组织。只加入 BA时，没有愈伤组织或原球茎出现，叶片出现增大现象，说明只使用分裂素不能诱导玫瑰石斛产生原球茎。当加入 2.0 mg/L的 BA与2,4-D时，在叶片基部逐渐出现原球茎结构，但生长速度较慢，说明在分裂素与2,4-D配合使用时可诱导出原球茎。为了提高原球茎的生长速度，在培养基中加入了NAA。结果显示，在BA浓度为1.0 mg/L时，加入2,4-D并附加NAA后，初期有类似原球茎产生，随着培养时间增加，逐渐转变为愈伤组织，说明较低浓度的 BA和较高浓度的2,4-D以及有NAA共同存在时，细胞容易转变为薄壁细胞，最终转变为愈伤组织细胞。当采用2.0 mg/L的BA与2,4-D附加0.5 mg/L的NAA时，诱导原球茎的效率与生长速度明显增加，说明NAA在原球茎加速生长方面起到了促进作用。综合以上结果，试验最终选择玫瑰石斛原球茎的诱导培养基为：MS＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L NAA。

表1 不同培养基诱导玫瑰石斛原球茎试验结果

2.2 不同植物激素配比对玫瑰石斛原球茎增殖培养的影响

从表2可以看出，在不同的增殖培养基上，玫瑰石斛原球茎的增殖与生长情况各不相同。具体来看，在继续使用诱导培养基 MS＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L NAA时，原球茎开始增长，但逐渐转变为结构松散的愈伤组织。当降低 2,4-D使用浓度时，原球茎生长速度较快，但在培养后期，原球茎颜色变白，质地变软，并向着愈伤组织转变，这说明加入 2,4-D时，原球茎会转变为愈伤组织。只使用 BA原球茎的生长速度较慢，且结构紧密，不是理想的原球茎类型，增加 BA用量，增殖速度变得更慢，同时原球茎紧密结合在一起，形成一团组织，说明只使用分裂素不利于其增殖培养。为此在培养基中加入了NAA，加入后生长状况明显改变，生长速度加快，结构也变得松散。对比0.5 m/L BA 与1.0 m/L BA，后者增殖效果更好一些，并可保持稳定原球茎长时间继代培养。因此，选用MS＋1.0 mg/L BA＋0.2 mg/L NAA增殖培养基，玫瑰石斛原球茎可以稳定增殖生长。

表2 玫瑰石斛原球茎在不同培养基上的增殖结果

3 结论与讨论

原球茎是多肉类植物在组培期间出现的一种特殊的组织结构，与胚性愈伤组织有着本质的区别。原球茎实质是球形不定芽结构，这种球形结构可在一定的培养基上形成完整的植株，是一种理想的组培快繁材料或人工种子的包埋物。胚性愈伤组织则是一种特殊愈伤组织，它具有愈伤组织的主要特点，但又有其独特性，是一种个体小、细胞质浓，分裂旺盛的愈伤组织，可以在无激素的培养基上形成胚状体，进而发育成苗[13]。原球茎通常使用植物激素诱导，首先，必须使用细胞分裂素，原球茎的诱导实际是分生组织的增殖过程，要求培养基中含有一定量的分裂素促进细胞增殖，同时也要加入一定量的生长素，促进原球茎细胞的快速生长[14]。如黄靖等[15]在铁皮石斛原球茎诱导中使用了BA与NAA，诱导出了原球茎，而在本试验中，除了使用这两种激素外，还加入了2,4-D，其主要作用不是使细胞脱分化转变为愈伤组织细胞，而是加快细胞的生长。因此，其用量一定要准确控制，过多会造成愈伤组织产生。在诱导原球茎过程中，适当减少渗透压也可以促进原球茎的形成，因为原球茎细胞快速生长时，低渗透压可以为细胞快速生长提供快速的营养与水分，如古碧珠等[16]在兰花种子的原球茎诱导试验时，采用 B5培养基有利于原球茎的诱导和分化。但有些植物中也可用 MS等渗透压较高的培养基培养，如本试验就采用 MS培养基诱导玫瑰石斛原球茎，诱导率可达 94%。另外，苏江等利用玫瑰石斛的茎段为外植体进行了原球茎的诱导，而本试验采用带有叶鞘组织的叶片为外植体同样可以诱导出原球茎，因为叶片叶鞘组织和茎段中均含有一定量的分生组织，这些分生组织可能对原球茎的分化有促进作用。总之，原球茎的诱导一定要根据试验材料采用适合的培养条件才能获得理想的原球茎。

本研究得出，利用玫瑰石斛叶片诱导原球茎的适宜方法为：将玫瑰石斛组培苗带叶鞘叶片接种于MS＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L BA＋0.5 mg/L NAA培养基上暗培养30 d，并继代培养2次，每次培养时间为20 d。玫瑰石斛原球茎适宜的增殖培养基为MS＋1.0 mg/L BA＋0.2 mg/L NAA。本试验结果可为玫瑰石斛人工种子的研制提供依据。