8%烯·丙·阿悬浮种衣剂研制及对大豆镰孢菌根腐病的防效

谭兆岩 康 泽 黄浩南 陈华保 龚国淑 雍太文 杨文钰 常小丽

(1四川农业大学农学院，四川 成都 611130；2四川省作物带状复合种植工程技术研究中心，四川 成都 611130)

随着我国供给侧结构调整，大豆种植面积呈逐年增加趋势。然而，根腐病作为大豆生产中的常发病害，在各大豆产区普遍发生，一般年份发生率达10%～75%，严重影响大豆产量[1-2]。其中，以尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)为主的多种镰孢菌是大豆根腐病的主要致病菌[3-5]。四川农业大学玉米大豆带状复合种植团队前期研究发现，尖孢镰孢菌和禾谷镰孢菌(F.graminearum)是引起四川套作大豆根腐病的2种主要致病菌[6-7]。国内外研究报道，连作、重茬等栽培方式能够改变根际土壤微生物群落结构，影响根腐病致病镰孢菌的种群[8-10]。加之，镰孢菌寄主范围广，可危害小麦、玉米、大豆等多种作物，在田间病残体、地表土或耕作土中均能够长期存活，导致镰孢菌引起的大豆根腐病一旦发生，很难防治[11-12]。

种子包衣是防治土传病虫害的有效措施之一。目前，市面常见种衣剂的有效成分以单剂居多，其用量大、残留多，容易引起病原菌产生抗药性。相比单剂，各类复配种衣剂不仅成本低、效率高、药效长、使用方便，而且能够有效延缓或避免病原菌抗药性的产生[13-14]。Weems 等[15]采用咯菌腈、精甲霜灵、嘧菌酯、甲霜灵、甲基硫菌灵等化学药剂的复配组合处理种子，在一定程度上有效控制了大豆猝死综合征(sudden death syndrome，SDS)。Chang 等[16]分别采用Apron Maxx(有效成分:咯菌腈和甲霜灵)、Vitaflo® 280(有效成分:萎锈灵+福美双)促进大豆发芽，提高了产量，并有效防控了燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的根腐病。刘秀林等[17]利用62.5 g·L-1精甲·咯菌腈悬浮种衣剂(亮盾)处理大豆种子后，其出苗率、单株鲜重、株高和产量均显著提高。但目前生产上可用的针对大豆根腐病的种衣剂种类较少，有必要研制更多类型的种衣剂，为大豆地下病虫害防治提供保障。

研究表明，烯效唑(uniconzole)具有促进植物矮健、抗倒伏、防衰老、改善大豆幼苗生长状况等功效，而且兼具杀菌作用，是一种高效低毒、低残留的植物生长调节剂[18-19]。丙环唑(propiconazole)是一种具有治疗和保护双重作用的内吸性三唑类广谱、高效、内吸输导性杀菌剂，可被根、茎、叶吸收，并能快速在植株体内向上传导，对根腐病、水稻恶苗病、纹枯病等多种病害具有显著防效[20]。阿维菌素(abamectin)是对害虫和螨类具有胃毒和触杀作用的一种抗生素，易被土壤吸附，能够被土壤微生物分解，已成为多种复配剂的有效成分[21-22]。目前尚无烯效唑、丙环唑和阿维菌素复配组合对大豆根腐病镰孢菌的毒力测试以及种衣剂研究。本研究通过测定烯效唑、丙环唑、阿维菌素单剂及其不同复配组合对大豆根腐病镰孢菌的毒力，旨在筛选对大豆根腐病具有较好防效的复配配方，并制备种衣剂，为有效防治大豆土传病虫害提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株及植物 供试菌株为大豆根腐病致病禾谷镰孢和尖镰孢，由四川农业大学植物病理系病原物分离与培养实验室从田间大豆根腐病病株上分离、鉴定并保存。室内盆栽药剂试验用大豆品种为南豆12，由四川农业大学作物遗传育种系留种备用。

1.1.2 供试药品及试剂 毒力测试及复配药剂:96%烯效唑原药，购自上海源叶生物科技有限公司；96%丙环唑原药，购自郑州瑞凯农化工产品有限公司；97%阿维菌素原药，购自武汉泽山成生物医药技术有限公司。

种衣剂制备试剂:十二烷基硫酸钠，购自美星化工产品有限公司；农乳6204＃、农乳600＃、分散剂NNO和木质素磺酸钠，购自邢台市蓝天精细化工有限公司；聚乙烯醇(PVA)和色素罗丹明B，购自上海源叶生物科技有限公司；羟丙基甲基纤维素，购自河北晴俊纤维素厂；黄原胶，购自郑州亨多宝化工有限公司；乙二醇，购自四川世纪鸿光科技有限公司。磷酸二氢钾、盐酸、氢氧化钾作为pH 调节剂，均购自成都温江万科生化有限公司。

室内盆栽苗试验:盆栽植物营养土(成分为泥炭营养土、蛭石和珍珠岩，pH值6.5)，购自成都温江瑞金特生化有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 室内药剂毒力测定 将实验室4℃保存的尖镰孢菌和禾谷镰孢菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)平板上，置于25±3℃黑暗条件下活化培养5 d。采用菌丝生长速率法测定唏效唑、丙环唑和阿维菌素3种原药对尖孢镰孢菌和禾谷镰孢菌的毒力[20]。制备含有0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10 μg·mL-15个不同浓度烯效唑、丙环唑和阿维菌素的PDA 培养基，添加3%(w/v)链霉素，将活化的病菌打菌饼(直径5mm)接种于该平板上，以未加入药剂的接菌平板为对照。每种药剂各浓度分别设置3个PDA 平板，试验重复3次。接菌后的PDA 平板置于25±3℃黑暗培养5 d，采用十字交叉法测量菌落生长直径，计算不同药剂下尖孢镰孢菌和禾谷镰孢菌的菌丝生长抑制率。以药剂浓度的对数值为自变量(x)，抑菌生长率的几率值为因变量(y)，建立毒力回归方程y=a+bx，获得相关系数，并计算各药剂抑制禾谷镰孢菌和尖孢镰孢菌菌丝生长的半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)。

1.2.2 烯效唑、丙环唑和阿维菌素复配 将烯效唑和丙环唑2种原药按有效成分配的质量分数制成1∶1、1∶3、3∶1、5∶1、1∶5共5个配比(w∶w)，分别进行毒力测定，以最优配比与阿维菌素进行复配，参照王丽等[23]的方法，计算不同复配组合的共毒系数(co-toxicity coefficient，CTC)以评价其联合作用类型。其中，CTC＜70为拮抗作用，70≤CTC＜120为相加作用，CTC≥120为增效作用。

1.2.3 8%烯·丙·阿悬浮种衣剂种衣剂制备 8%烯·丙·阿悬浮种衣剂包括活性成分和助剂，选择3种原药的最佳配比配制活性成分，参照向兴等[24]的助剂配方，分别对分散剂(农乳6204＃、农乳600＃、木质素磺酸钠和分散剂NNO)和成膜剂(聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素和黄原胶)的含量进行优化，并添加润湿剂十二烷基硫酸钠2%(质量分数w/v)，防冻剂乙二醇2%，色素罗丹明B 1% wt，用水补足至100%。将成膜剂加入85%种衣剂总体积的蒸馏水，在90℃水浴锅中持续加热、搅拌，熬制成均一、透明、无不溶物的胶状物。然后按质量分数将其他组成成分混合，加入已制备好的成膜剂溶液，放入胶体磨中研磨20 min，转入MJa75/1.1 多功能研磨搅拌机(重庆华银机电开发有限公司)研磨30 min，然后采用ESB-500X 高速乳化剪切机(上海易勒机电设备有限公司)以8 000 r·min-1高速搅拌、剪切、调匀、分散10 min，制备成8%烯·丙·阿悬浮种衣剂。测定悬浮种衣剂的外观、pH、悬浮率、粘度、成膜性、稳定性及分散性等指标[24]。其中悬浮种衣剂分散性的测定标准分为五级:一级，能迅速自动均匀分散，稍加搅动呈粉红色乳状液；二级，能自动均匀分散，稍加搅动呈粉红色半透明乳状液；三级，呈粉红色云雾状或丝状分散，搅动后呈粉红色不透明状乳状液；四级，呈粉红色颗粒状下沉，搅动后呈粉红色不透明乳状液；五级，呈油珠状下沉，搅动能乳化，停止搅动后很快分层。

1.2.4 试验处理 设置8%烯·丙·阿悬浮种衣剂药种比为0.2、0.5、1和2 g·kg-1，以清水处理为阴性对照，共5个处理，将种衣剂与大豆种子按药种比充分搅拌均匀后，播种于装有植物营养土(泥炭营养土、蛭石和珍珠岩，pH值6.5)直径15 cm的花盆中。每盆10粒，每个处理6 盆，重复3次。将花盆置于人工气候箱中(25℃，85% RH，L/D=16 h/8 h)，分别于第5天统计发芽率，于第20 天统计出苗率和株高。

1.2.5 种衣剂对盆栽大豆根腐病的防效检测 参照Chang 等[6]的高粱粒接种法，检测种衣剂对大豆镰孢根腐病的室内防效。在直径15 cm的花盆中装入1/3体积的灭菌培养基质，均匀撒入2 cm 厚的带菌高粱粒，盖上一层培养基质。分别采用8%烯·丙·阿悬浮种衣剂药种比为0.2、0.5、1和2 g·kg-1处理大豆种子，以清水为空白对照(CK)。取处理后的种子10 粒播种于培养基质中，将花盆放置于人工气候室(25℃，85%RH，L/D=16 h/8 h)。每个处理3次重复，每个重复3个花盆。于播种后20 d 调查根腐病发病率，并依据马淑梅[25]的根腐病分级标准，计算病情指数与种衣剂对根腐病的防效。

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0 软件，比较均值中单因素的方差分析，采用ANOVA 方法对田间试验各项数据进行分析比较。

2 结果与分析

2.1 单剂对镰孢菌的室内毒力测定结果分析

由表1可知，3种单剂对尖镰孢菌和禾谷镰孢菌均具有抑制作用，其中，丙环唑对尖孢镰孢菌的抑菌效果较烯效唑好，丙环唑和烯效唑对尖孢镰孢菌的EC50分别为0.09 μg·mL-1和9.59 μg·mL-1，阿维菌素对2种镰孢菌也表现出一定的抑制作用。

表1 不同单剂对镰孢菌的室内毒力测定结果Table1 Toxicity of single chemical agent on Fusarium spp.indoor

2.2 烯效唑与丙环唑不同复配组合对镰孢菌的联合作用效果

由表2可知，烯效唑与丙环唑的复配比为1∶1和1∶5时，其对禾谷镰孢菌的CTC 均低于70，表现为拮抗。当烯效唑与丙环唑的复配比为1∶1、1∶3和1∶5时，其对尖孢镰孢菌的CTC 均低于70，表现为拮抗。其中，当烯效唑与丙环唑的复配比为5∶1时，其对2种镰孢菌的CTC 分别为345.88和437.68，均表现为增效，综合表现最好。

以烯效唑与丙环唑复配比5∶1为基础，测定烯效唑、丙环唑与阿维菌素不同配比对2种镰孢菌的毒力，结果如表3所示，各配比对2种镰孢菌的联合毒力均表现为相加或增效作用，其中当烯效唑、丙环唑与阿维菌素复配比为5∶1∶2时，其对禾谷镰孢菌和尖孢镰孢菌的CTC 分别为108.84和201.60，表现为相加和增效作用；考虑节约药剂成本和毒力效果，以5∶1∶2为最佳配比，用于种衣剂制备。

表2 烯效唑与丙环唑复配对镰孢菌的联合毒力测定结果Table2 Combined toxicity of the mixture of uniconzole and propiconazole on Fusarium spp.

表3 烯效唑、丙环唑与阿维菌素复配对镰孢菌的联合毒力测定结果Table3 Combined toxicity of the mixture of uniconzole，propiconazole and abamectin on Fusarium spp.

2.3 种衣剂助剂筛选分析

通过对悬浮种衣剂助剂进行筛选，如表4所示，采用分散剂木质素磺酸钠5.0% wt，成膜剂黄原胶0.3%wt，润湿剂十二烷基硫酸酸钠2.0% wt，防冻剂乙二醇2.0% wt，色素罗丹明1.0% wt，以湿研磨法制备8%烯·丙·阿悬浮种衣剂的悬浮率达95%以上，且分散性表现为一级，能迅速均匀分散。测定种衣剂其他参数发现(表5)，pH、热稳定性、冷稳定性、成膜性、倾倒性均表现合格，可用于种子包衣处理。

2.4 室内盆栽苗药效试验结果分析

由表6可知，播种20 d 后，与对照相比，8%烯·丙·阿悬浮种衣剂用量为0.2～0.5 g·kg-1时对大豆发芽率的影响不显著，但可显著促进大豆出苗；不同用量8%烯·丙·阿悬浮种衣剂处理均能显著抑制株高，高浓度抑制效果更明显。因此，低用量8%烯·丙·阿悬浮种衣剂(0.2～0.5 g·kg-1)处理能够在一定程度上促进出苗，降低株高，安全性高。

表4 8%烯·丙·阿悬浮种良剂的助剂筛制Table4 Screening of auxiliary agents of 8%uniconzole·propiconazole·abamectin suspension seed coating agent

表5 8%烯·丙·阿悬浮种衣剂各项参数检测结果Table5 Parameters of 8%uniconzole·propiconazole·abamectin suspension seed coating agent

接种后10 d 观察根腐病症状(图1)，检测各用量8%烯·丙·阿悬浮种衣剂对大豆根腐病致病尖孢镰孢菌和禾谷镰孢菌的防治效果，与对照相比，未经种衣剂处理后接种的植株均有不同程度的发病，表现为主根褐化坏死，或侧根生长受抑制；而0.2～0.5 g·kg-1用量种衣剂处理后接种的植株未见明显发病症状，且根系生长良好，但高浓度种衣剂处理(1.0～2.0 g·kg-1)对植株生长有一定程度的抑制作用。于接种后20 d 评估种衣剂室内防效，如表7所示，与对照相比，0.2～2.0 g·kg-1用量种衣剂处理后，2种致病镰孢菌引起的大豆根腐病的发病率和病情指数均显著降低，且低浓度处理效果更好；种衣剂用量为0.2～0.5 g·kg-1时，其对镰孢菌根腐病的防效达80.10%以上，浓度过高则防效降低。综合考虑，8%烯·丙·阿悬浮种衣剂用量为0.2～0.5 g·kg-1时，其对2种镰孢菌根腐病的防效更好。

表6 8%烯·丙·阿悬浮种衣剂室内安全性试验Table6 Security tests of 8%uniconzole·propiconazole·abamectin suspension seed coating agent

表7 8%烯·丙·阿悬浮种衣剂对盆栽大豆镰孢菌根腐病的防效Table7 Control effect of 8%uniconzole·propiconazole·abamectin suspension seed coating agent on Fusarium root rot of soybean seedlings planted in the pots

图1 8%烯·丙·阿悬浮种衣剂对镰孢菌接种后10 d的大豆根腐病室内盆栽苗发病情况Fig.1 Control efficiency of Fusarium root rot of soybean at 10 d after inoculation with 8%uniconzole·propiconazole·abamectin suspension seed cocting agent

3 讨论

长期连续使用单一农药，容易导致病虫害不同程度地产生抗药性，从而降低防治效果。选择具有不同功能的杀菌、杀虫、植物生长调节剂或者生防菌，进行合理复配获得不同农药制剂，可以提高防治效果，且能够延缓抗药性的产生。研究表明，烯效唑等三唑类植物生长调节剂，能促进植物矮壮，提高抗逆境能力[26]。雍太文等[27]发现烯效唑干拌种可显著降低大豆株高，缩短节间，增加茎粗，提高大豆产量和品质。前人研究发现烯效唑处理能提高水稻秧苗对镰孢菌和立枯丝核菌复合侵染引起的立枯病的抗性[28]。本试验选用烯效唑为种衣剂有效成分之一，结果表明，烯效唑对根腐病2种致病镰孢菌抑菌活性均较强，对禾谷镰孢菌抑制作用尤为明显，可能与禾谷镰孢菌对烯效唑更敏感有关，因此将烯效唑作为大豆种衣剂有效成分兼有调节植物生长和杀菌的作用。丙环唑是具有内吸性的三唑类杀菌剂，唐正合等[20]研究表明丙环唑对水稻纹枯病菌的菌丝生长、菌核形成具有强抑制作用，导致萌发后的菌丝致病力下降，产菌核能力和数量下降，从而减少翌年水稻纹枯病的初侵染源，且丙环唑能很好地被水稻根系吸收，并输送至水稻茎部和叶鞘，以达到防治作用。郭宁等[29]发现丙环唑对黄淮海地区玉米叶斑类病害防治效果达60%以上，产量损失减少11%。但长期、大量使用丙环唑单剂容易造成病原菌产生抗药性，甘林等[30]在福建省内分离获得了185株玉米小斑病菌，采用菌丝生长速率法测定了这些菌株对丙环唑、烯唑醇和咪鲜胺的敏感性，结果显示玉米小斑病菌群中已出现对3种杀菌剂敏感性降低，抗药性增强的菌株，因此生产上需要更多复配杀菌剂以减少抗药性产生的风险。自2006年，35.6%阿维菌素·多菌灵·福美双悬浮种衣剂获得农业部农药临时登记证后，多种药剂与阿维菌素复配的种衣剂被研制，广泛用于防治各类土传病虫害，并取得了较好效果[17]。付志能等[31]采用叶片残毒法测定了阿维菌素等4种药剂对朱砂叶蟃雌成螨的毒力及其复配剂的联合作用，明确了阿维菌素复配剂可有效克服或延缓害螨抗性的产生，且能提高药效、降低成本。张长平[32]以阿维菌素和嘧菌酯为有效成分，研制了一种用于防治水稻病虫害的复配杀虫杀菌剂，其对水稻纹枯病、稻瘟病及稻纵卷叶螟等多种水稻病虫害防效较好，具有一药多效、病虫兼防、成本低、环境友好等特性。本试验将植物生长调节剂烯效唑、杀菌剂丙环唑和杀虫剂阿维菌素进行复配制备新型种衣剂，不仅能够促进大豆生长、壮苗，而且兼具杀菌、杀虫多种功效，提高了农药使用效率，降低了成本，具有良好的应用前景。

本试验采用室内盆栽苗试验通过大豆根腐病2种主要致病镰孢菌单独或混合接种，以验证种衣剂的防效，未进行田间试验验证，也未考虑田间实际发病时存在其他病菌，如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、腐霉菌(Pythiumsp.)、疫霉菌(Phytophthora sojae)等[24]复合侵染的情况，未来将进一步开展田间试验，明确该种衣剂的应用效果，扩大其应用范围。

4 结论

本研究选取烯效唑、丙环唑和阿维菌素3种药剂不同复配组合对大豆根腐病致病菌尖孢镰孢菌和禾谷镰孢菌的毒力进行测定，筛选获得了最佳复配比，并制备了8%烯·丙·阿维菌素悬浮种衣剂，进一步通过室内盆栽试验，测定了该种衣剂对大豆的安全性，以及对2种镰孢菌接种后大豆根腐病的防效。结果显示，烯效唑、丙环唑和阿维菌素的配比为5∶1∶2时增效作用明显，采用8%烯·丙·阿维菌素悬浮种衣剂用量为0.2～0.5 g·kg-1时，大豆种子对大豆尖孢镰孢菌和禾谷镰孢菌根腐病的相对防效达80.10%以上。本研究结果为进一步开展大豆根腐病和根部虫害田间防治及推广应用奠定了一定的理论基础。