下调长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1表达对胃癌HGC-27细胞生长和顺铂敏感性的影响

王 亮, 张 龙, 石 伟

王亮, 天津市第五中心医院药剂科 天津市 300450

张龙, 石伟, 河北医科大学药理组 河北省石家庄市 050017

核心提要： 本研究首次证实KCNQ1OT1在胃癌(gastric cancer, GC)细胞中呈高表达, 抑制KCNQ1OT1表达可抑制GC细胞增殖、迁移及侵袭, 还可增强顺铂敏感性.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一种临床常见的消化系统肿瘤, 在全世界仍然是一个相当大的健康负担[1].尽管, 我国GC的发病率已趋于平稳, 但总发病人数还在不断增加[2].目前, 以铂类药物为基础的化疗仍是GC中晚期患者常用的治疗手段, 但化疗药物的长期或不规范使用会产生耐药抵抗, 导致治疗效果不太理想[3].因此, 深入探讨GC发生发展的分子机制, 寻找有效提高肿瘤细胞对铂类化疗药物敏感性的方法具有重要意义.越来越多的研究[4-6]显示, 长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)可通过调控基因表达在GC发生发展和耐药形成过程中发挥着重要作用.lncRNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcript 1, KCNQ1OT1)定位于人11p15.5染色体上, 是KCNQ1的反义链转录物, 被报道与结直肠癌和卵巢癌等肿瘤恶性进展和顺铂耐药密切相关[7,8].有学者[9,10]指出, 在GC组织和细胞中KCNQ1OT1表达上调, 且高表达KCNQ1OT1与患者淋巴结转移和不良预后有关, 但其在GC中的作用并不清楚.本研究通过观察下调KCNQ1OT1表达对HGC-27细胞增殖、侵袭、迁移和顺铂敏感性的影响, 旨在揭示KCNQ1OT1在GC发生发展中的作用, 以期为GC的治疗提供新线索.

1 材料和方法

1.1 材料 HGC-27细胞(美国ATCC), 细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)(北京百奥生物), RPMI-1640培养基(美国HyClone), 胎牛血清(杭州四季青), 细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒(江苏南京凯基),顺铂(美国Sigma), 逆转录试剂盒、ECL发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE配胶试剂盒(上海碧云天), 上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体和山羊抗兔或鼠HRP标记的IgG二抗(美国Santa Cruz),Trizol试剂和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen), 靶向KCNQ1OT1的小干扰RNA KCNQ1OT1-siRNA(UGAG CGUAGCAUCGAGAGCGUACGUCGAUCGAC)及其阴性对照NC-siRNA(上海吉玛).Matrigel和FACSCalibur流式细胞仪(美国BD), Varioskan LUX多功能酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific), Transwell小室(美国Corning),BB15二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo), ProFlexTM聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)仪(美国ABI), ChemiDoc MP凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad).

我院围手术期质子泵抑制剂使用情况调查及合理性评价…………………………………………………… 马志会等（12）：1715

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理： HGC-27细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37 ℃、5%二氧化碳细胞培养箱中常规培养.将对数生长期的HGC-27细胞以每孔2×105个接种至6孔细胞板上后, 常规培养约至70%融合度时, 参照Lipofectamine 2000说明书步骤进行瞬时转染.将转染KCNQ1OT1-siRNA的细胞作为KCNQ1OT1-siRNA组, 转染NC-siRNA的细胞作为NC-siRNA组, 以正常培养的细胞作为对照组.转染5 h后更换新鲜培养基, 继续培养48 h后收集对照组、NC-siRNA组和KCNQ1OT1-siRNA组细胞并采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)法检测各组细胞中KCNQ1OT1的表达水平以评价转染效果.另外, 将转染KCNQ1OT1-siRNA后给予顺铂处理48 h的细胞, 通过CCK-8法检测细胞活力, 并计算细胞的半数抑制浓度(half- maximal inhibitory concentration, IC50)值[11].

1.2.2 qRT-PCR检测KCNQ1OT1表达： 采用Trizol法提取HGC-27细胞总RNA后, 参照逆转录试剂盒说明书步骤将RNA反转录合成cDNA.以cDNA为模板, 在20 μL反应体系下根据设定的PCR反应条件(94 ℃预变性3 min, 94 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s, 循环40次)上PCR仪进行扩增.以GAPDH为管家基因, 采用2-△△Ct法计算HGC-27细胞中KCNQ1OT1的表达水平.其中, 由上海生工生物工程合成的PCR引物序列如下：KCNQ1OT1上游： 5'-CCTCCCTCACTGAGCTTTGG-3',下游： 5'-GTGCGGACCCTATACGGAAG-3'; GAPDH上游： 5'-GCTGCTGAGTATGTCGTGGAGT-3', 下游：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'.

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖： 收集转染48 h后的NC-siRNA组、KCNQ1OT1-siRNA组和对照组HGC-27细胞, 按照每孔105个接种至96孔细胞板上, 其中每组设置3个复孔; 置于细胞培养箱中常规培养24 h、48 h、72 h和96 h后, 弃培养液, 每孔加入10 μL CCK-8试剂孵育2 h.采用酶标仪检测HGC-27细胞在450 nm处的吸光度(optical density, OD)值, 实验重复3次.

1.2.4 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移： (1)侵袭实验： 将50 μL Matrigel均匀地铺在(浓度为500 ng/μL)Transwell小室内面上, 置于细胞培养箱内孵育4 h使其凝固.向24孔细胞板中每孔加入含血清培养基600 μL, 将Transwell小室放入24孔细胞板中, 并在小室上室中每孔加入200 μL细胞悬液(浓度为105个/mL); 放入培养箱内常规培养24 h后, 将小室取出.以棉签小心拭去上室面残留的细胞后, 将小室放入4%多聚甲醛固定液中固定30 min; 再以0.1%结晶紫染色15 min后, 采用显微镜观察统计各组细胞的穿膜细胞数, 结果以随机选取的3个视野内细胞数的均值表示.实验重复3次; (2)迁移实验：Transwell小室不需药使用Matrigel铺盖, 其余不同与侵袭实验相同.

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期： 收集转染48 h后的NC-siRNA组、KCNQ1OT1-siRNA组和对照组HGC-27细胞, 加入预冷的70%乙醇溶液在-20 ℃下孵育24 h.弃上清后, 加入0.1 mL RNase(浓度5 μg/mL)和0.5 mL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)(浓度50 μg/mL)于37 ℃下避光反应30 min.采用流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况.

1.2.6 免疫印迹法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、P-糖蛋白、多药耐药关联蛋白1蛋白表达： 将HGC-27细胞中加入细胞裂解液提取总蛋白后, 采用BCA法检测总蛋白的浓度与纯度.将变性后的蛋白样品上样至SDS-PAGE凝胶中行电泳分离.电泳结束后, 转PVDF膜.以5%脱脂奶粉封膜2 h后, 加入E-cadherin(1：800)、N-cadherin(1：800)、Vimentin(1：1000)、P-gp(1：1000)、MRP1(1：1000)和GAPDH(1：1000)抗体于4 ℃下孵育24 h.再以HRP标记的IgG二抗(1：5000)室温孵育2 h后, 加入ECL显影曝光.以GAPDH为内参, 采用凝胶成像分析系统扫描分析HGC-27细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平.实验重复3次.

统计学处理实验所得数据以mean±SD形式表示,采用SPSS 22.0软件进行统计学分析, 多组间比较使用单因素方差分析, 组间多重比较采用SNK-q, 两组间比较采用独立样本t检验.P＜0.05代表差异有统计学意义.

2 结果

2.1 转染后HGC-27细胞中KCNQ1OT1表达 与对照组比较, NC-siRNA组细胞中KCNQ1OT1表达水平差异无统计学意义(P＞0.05); 与NC-siRNA组或对照组比较,KCNQ1OT1-siRNA组细胞中KCNQ1OT1表达水平明显降低(P＜0.05)(图1).

2.2 下调KCNQ1OT1表达对HGC-27细胞增殖的影响 与对照组比较, NC-siRNA组细胞在转染后继续培养不同时间后增殖活力差异无统计学意义(P＞0.05); 与对照组或NC-siRNA组比较, KCNQ1OT1-siRNA组细胞在转染后继续培养48 h、72 h和96 h后增殖活力明显降低(P＜0.05)(图2).

2.3 下调KCNQ1OT1表达对HGC-27细胞周期的影响 与对照组比较, NC-siRNA组细胞在G0/G1期、S期和G2/M期所占百分比差异均无统计学意义(P＞0.05); 与对照组或NC-siRNA组比较, KCNQ1OT1-siRNA组细胞在G0/G1期所占百分比明显升高, 而在S期和G2/M期所占百分比明显降低(P＜0.05)(图3).

2.4 下调KCNQ1OT1表达对HGC-27细胞侵袭和迁移的影响 与对照组比较, NC-siRNA组细胞侵袭数目和迁移数目差异均无统计学意义(P＞0.05); 与对照组或NC-siRNA组比较, KCNQ1OT1-siRNA组细胞侵袭数目和迁移数目均明显减少(P＜0.05)(图4).

2.5 下调KCNQ1OT1表达对HGC-27细胞上皮间质转化的影响 与对照组比较, NC-siRNA组细胞中上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05); 与对照组或NC-siRNA组比较, KCNQ1OT1-siRNA组细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高, 而N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)(图5).

2.6 下调KCNQ1OT1表达对HGC-27细胞顺铂耐药性的影响 与NC-siRNA组比较, KCNQ1OT1-siRNA组P-gp蛋白水平显著降低(P＜0.05), MRP1蛋白水平显著升高(P＜0.05), IC50值明显降低(P＜0.05)(图6).

3 讨论

lncRNA是一类可在表观遗传水平、转录和转录后水平调控基因表达的长链非编码RNA, 不具备编码蛋白的功能, 在维持基因稳定性和促进DNA修复等过程中发挥着重要作用[12].研究[13-15]显示, 在GC组织或细胞中存在异常表达的lncRNA, 并且这些lncRNA可通过调控细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为参与GC的发生发展和耐药形成.

KCNQ1OT1是lncRNA成员, 其在肿瘤发生发展中的作用逐渐引起关注.KCNQ1OT1在结肠癌组织中表达上调, 且其表达水平与患者总生存期和无复发生存率缩短有关, 被认为是结肠癌独立预后指标[16].在膀胱癌中KCNQ1OT1发挥着原癌基因的作用, 敲低KCNQ1OT1表达可通过调控miR-145-5p/PCBP2轴抑制肿瘤细胞增殖、迁移并促进细胞凋亡[17].此外, KCNQ1OT1高表达还与肿瘤化疗耐药有关.在抗奥沙利铂肝癌细胞KCNQ1OT1表达上调, 敲低KCNQ1OT1除了可通过调控miR-7-5p/ABCC1表达抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移外, 还可通过降低耐药基因MRP5、MDR1和LRP1表达降低肿瘤细胞对奥沙利铂的耐药抵抗[18]; KCNQ1OT1可通过靶向调控miR-211-5p表达促进舌鳞状细胞癌细胞增殖并抑制顺铂诱导的细胞凋亡, 而敲低其表达可挽救肿瘤细胞的顺铂抵抗, 被认为是舌鳞状细胞癌治疗的新靶点[19].

图1 各组细胞中长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1表达水平的比较.与对照组或NC-siRNA组比较, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1.

图2 各组细胞增殖活力的比较.与对照组或NC-siRNA组比较,aP＜0.05.KCNQ1OT1: 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1; OD:吸光度.

图3 各组细胞周期分布比较.与对照组或NC-siRNA组比较,aP＜0.05.KCNQ1OT1: 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1.

图4 各组中侵袭数目和迁移数目的比较.与对照组或NC-siRNA组比较, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1; Migration: 细胞迁移数量; Invasion: 细胞侵袭数量.

KCNQ1OT1在GC组织和细胞中呈现异常高表达,且其表达水平的改变与患者不良预后密切相关, 但其在GC细胞生长和顺铂耐药抵抗中的作用并不清楚.GC的发生与发展是一个多因素、多阶段和多基因调控的复杂过程, 其中细胞周期失调导致的恶性增殖是GC发生发展的重要机制[20].本研究下调 KCNQ1OT1表达后发现, HGC-27细胞增殖能力明显减弱; 同时, HGC-27细胞在G0/G1期所占百分比明显升高, 在S期和G2/M期所占百分比明显减少.结果表明, 下调KCNQ1OT1表达可通过诱导细胞周期阻滞于G0/G1期抑制GC细胞增殖.此外, 侵袭转移是肿瘤发生发展的重要特征[21], 而上皮间质转化是上皮来源肿瘤细胞获得侵袭能力的重要环节, 与GC细胞浸润和转移密切相关[22-23].本研究发现,下调 KCNQ1OT1表达还可使HGC-27细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白表达升高, 而间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低, HGC-27细胞侵袭和迁移能力减弱.结果表明, 下调KCNQ1OT1表达可通过抑制GC细胞上皮间质转化抑制癌细胞侵袭和迁移.提示,KCNQ1OT1可通过调控细胞增殖、侵袭和迁移在GC发生发展过程中发挥着重要的促癌作用.顺铂是GC化疗是常用药物之一, 但化疗过程中易产生耐药; 而靶向调控基因表达可增强顺铂对细胞的敏感性, 降低其耐药抵抗, 有望成为GC化疗的增敏剂[24-25].本研究以靶向干扰KCNQ1OT1表达后发现, 顺铂IC50值显著降低, P-gp蛋白水平降低, MRP1蛋白水平升高, 说明下调KCNQ1OT1表达可提高顺铂对GC细胞的敏感性.提示,KCNQ1OT1在GC化疗耐药过程中发挥着重要作用, 而靶向干扰KCNQ1OT1表达可能是改善GC化疗耐药的重要策略.

综上所述, 下调KCNQ1OT1表达可抑制HGC-27细胞增殖、侵袭、迁移并增强细胞对顺铂的敏感性.本研究初步揭示了KCNQ1OT1在GC中的作用, 其具体的作用机制还需进一步深入探讨.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer, GC)是临床常见的恶性肿瘤, 其发病率与死亡率逐年上升, 目前关于GC发生及转移的分子机制尚未阐明, 因而探寻转移相关基因对揭示GC发生及发展的分子机制具有重要意义.

实验动机

临床主要采用手术结合放化疗的方式进行治疗, 但患者极易产生耐药性, 因而探究GC细胞耐药性机制有助于提高治疗效果及改善患者预后.

图5 免疫印迹法检测上皮型钙黏蛋白、神经型钙黏蛋白和波形蛋白表达.与对照组或NC-siRNA组比较, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1; E-cadherin: 上皮型钙黏蛋白; N-cadherin: 神经型钙黏蛋白; Vimentin: 波形蛋白; GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

图6 下调长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1表达对胃癌HGC-27细胞顺铂耐药性的影响.A: Western Blot检测P-糖蛋白、多药耐药关联蛋白1的表达; B: 各组细胞的半数抑制浓度比较.与对照组比较, aP＜0.05.KCNQ1OT1: 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1; P-gp: P-糖蛋白;MRP1: 多药耐药关联蛋白1; GAPDH: 甘油醛-3-磷酸脱氢酶; IC50: 半数抑制浓度.

实验目标

探讨下调长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 opposite strand/antisense transcript 1, KCNQ1OT1)表达对GC细胞增殖、迁移及侵袭的影响及分子机制, 并探讨细胞对顺铂的敏感性.

实验方法

采用实时荧光定量聚合酶链式反应方法检测GC细胞中KCNQ1OT1的表达, MTT检测细胞增殖, Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭, Western blot法检测细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达.检测IC50值及耐药相关蛋白表达从而探究KCNQ1OT1对细胞耐药性的影响及其作用机制.

实验结果

KCNQ1OT1在GC细胞中呈高表达, 抑制KCNQ1OT1表达可显著抑制细胞增殖、迁移及侵袭, 还可诱导细胞周期阻滞, 同时抑制KCNQ1OT1表达可增强细胞敏感性.

实验结论

抑制KCNQ1OT1表达可抑制GC细胞增殖、侵袭、迁移并增强细胞对顺铂的敏感性.

展望前景

KCNQ1OT1可能作为GC诊断及治疗的潜在靶点, 还可能为GC敏感性药物研发奠定理论基础.