水产养殖环境中芽孢杆菌的筛选及生长特性研究

许有燊 陈钊 李霞 李健

摘 要：为了筛选可高效降解养殖废物的菌株，分析其生长特性，从对虾工厂化养殖水体中分离出1株芽孢杆菌（Bacillus sp. Strain YS-1），研究了环境因子对其生长的影响。结果表明，芽孢杆菌适宜生长条件为：pH6.5?8.5，温度25?37℃，盐度5～15‰，转速240r/min，葡萄糖浓度0～0.2mg/L，[NH+4]浓度0～2mg/L。最佳培养参数为：温度32.9℃，盐度14‰，pH6.9。拟合多元二次回归模型具有显著性（P<0.05），失拟检测结果不显著（P>0.05），决定系数R2=0.9492，校正系数Adj R2=0.8838，方程拟合效果良好。

关键词：对虾工厂化养殖;芽孢杆菌;生长;理化因子;响应面模型

中图分类号 S917.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）05-0041-07

Screening and Optimization of Culture Conditions of Bacillus sp. Strains

Xu Youshen1，2 et al.

（1Dalian Ocean University， Dalian  116023， China; 2Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

Abstract： In order to screen strains that can efficiently degrade aquaculture wastes and analyze their growth characteristics， a strain of Bacillus sp. Strain was isolated from shrimp farmed water， and the effects of environmental factors on its growth were studied. Through single-factor physical and chemical factor experiments， it was found that the optimal growth condition of Bacillus sp. Strain YS-1 is： pH 6.5?8.5， temperature 25?37℃， salinity 5?15‰， speed 240r/min， glucose concentration0～0.2mg/L， NH4+0～2mg/L. The optimal culture parameters of the bacteria were： the temperature 32.9℃， the salinity 14‰，and the pH 6.9.The fitted multivariate quadratic regression model was significant（P<0.05）， and the results of misfit detection were not significant（P>0.05）. The determination coefficient R2 = 0.9492 and the correction coefficient Adj R2=0.8838. The equation fitting effect was better.

Key words： Factory shrimp farming; Bacillus sp.; Growth; Physicochemical factor; Response surface model

水产养殖集约化的快速发展，提升了养殖经济效益，但养殖系统中过高的污染物负荷使得养殖水环境管控面临巨大挑战，特别是残饵粪便、可溶性有机物、氨氮和亚硝酸盐超标等污染问题。养殖水体污染不仅会影响水产养殖动物的健康与生长，同时养殖废水直接排放将导致近岸水域的富营养化，破坏周边的生态环境，这严重阻碍了水产养殖业的可持续发展[1]。據报道，在高密度养殖水体中化学需氧量（Chemical oxygen demand，COD）可达40mg/L以上，氨氮与亚硝酸盐含量可达10mg/L以上[2-4]。

根据我国《海水养殖排放水要求》规定养殖废水排放至少需要达到二级排放水要求，即COD不得超过20mg/L，无机氮含量不得超过1mg/L[5]。为了达到养殖废水排放标准，养殖水体在排放前必须经过一定净化处理，微生物处理是其中高效且经济的一种方法。

关于益生菌对养殖水体中的有机物、氨氮和亚硝酸盐降解的研究此前多有报道，芽孢杆菌是其中常用的细菌。李永芹等[6]将刺参底泥中分离出来的枯草芽孢杆菌，再应用于养殖水体，其氨氮降解率达到81.9%。孟睿等[7]用芽孢杆菌处理罗非鱼养殖废水，6d后COD和亚硝酸盐降解率分别为50.32%和99.15%;祁自忠等[8]利用枯草芽孢杆菌处理模拟养殖废水，48h内COD浓度降解率为55.73%。在养殖系统中加入芽孢杆菌可以有效去除废水中的有机物、无机氮等污染物，维持养殖水体微生态的平衡。所以筛选出适应对虾工厂化养殖环境的芽孢杆菌菌株具有重要意义。

微生物生长有其最适条件，而微生物生长最适条件往往与养殖环境存在一定冲突。为了缩小养殖环境与益生菌适宜生长条件间的差距，更好的发挥益生菌在水环境调控中的作用，本实验开展了菌株适宜生长条件的研究，为菌株在水产养殖中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验方法

1.1.1 菌株的分离与筛选 芽孢杆菌分离样品来自海阳市黄海水产有限公司对虾工厂化养殖水体，将对虾工厂化养殖水样以1∶5的比例接种到富集培养基内，30℃培养24h，将培养好的菌悬液置于80℃水浴锅中加热20min，筛选芽孢杆菌。将处理过的菌悬液10倍梯度稀释，吸取不同浓度的稀释液，涂布于LB营养琼脂的平板上，30℃培养36～48h。菌落长出后，根据其培养基上外观形态特征，挑取单菌落进行纯培养，分离纯化3代后获得单一菌株，命名为YS-1菌株。将处于对数生长期的菌悬液与50%甘油1∶1混合，放入-80℃冰箱保存。

1.1.2 菌株鉴定 将纯化后的菌悬液置于90℃水浴锅中加热10min，再冰浴10min，以破坏细胞结构，释放其DNA模板。利用16S rRNA基因通用引物，正向引物为27F，反向引物为1492R建立如下反应体系（20μl）：MIX（10μl）、无菌水（6μl）、上下游引物（各1μl）、模板（1μl）、酶（0.1μl）。PCR扩增程序如下：95℃10min，（95℃变性30s，55℃40s，72℃1min）×35循环，72℃延伸7min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测。PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司测序，将所获序列在NCBI中进行Blastn同源序列比较，鉴定菌株。

1.1.3 单因素实验 从-80℃冰箱中取出保藏的菌种，以1%接种量接种到100mL TSB液体培养基中，30℃、120r/min培养12h以活化菌种。将活化好的菌悬液，用无菌水10倍梯度稀释，涂布于LB营养琼脂的平板上，同时做3组重复，置于恒温培养箱中30℃培养24h，计数菌落个数。细菌培养液光密度值（OD600nm）采用IMARK型酶标仪（日本伯乐）测定，溶液酸碱度采用意大利哈纳HANNA HI98103型笔式酸度计完成，接种实验在超净工作台内完成。

选取温度、盐度、pH、转速、碳源和氮源6个环境因子做单因素实验，每个因子设计5个梯度，每个梯度设置3个重复。将活化后菌悬液，以1%接种量接种到100mL培养基中。单因素实验中，控制其余条件与菌种活化条件相同。其中温度、盐度、转速、pH单因素实验使用TSB培养基，碳源和氮源单因素实验使用基础发酵培养基。基础发酵培养基：葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、pH7.0～7.5。葡萄糖、蛋白胨、NH4CL、NaCl、MgSO4·7H2O和其他化学试剂皆为分析纯，其中蛋白胨为北京奥博星生物技术有限责任公司产品，余者皆购自于国药集团化学试剂有限公司。富集培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB），由北京陆桥技术有限公司生产。LB营养琼脂由青岛高科园海博生物技术有限公司生产。

pH：采用1mol/L的NaOH和HCL调节TSB培养液的酸碱度，设置5.5、6.5、7.5、8.5、9.5共5个梯度，接种后，30℃、120r/min下培养，每隔1h取样，600nm下测定吸光度;温度：设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃共5个梯度，接种后，120r/min转速下培养，每隔1h取样，600nm下测定吸光度;盐度：向TSB培养基中添加NaCl调整盐度为5、15、25、35、45共5个梯度，接种后，30℃、120r/min下培养，每隔1h取样，600nm下测定吸光度;转速：设置80r/min、120r/min、160r/min、200r/min、240r/min共5个梯度，接种后，30℃下培养，每隔1h取样，600nm下测定吸光度;碳源：采用10mg/L的葡萄糖溶液配制基础发酵培养基，设置葡萄糖梯度0、0.01、0.1、0.2、0.5mg/L，接种后，37℃、160r/min下培养，每隔1h取样，600nm下测定吸光度;氮源：以氨氮替换培养基中蛋白胨，采用10mg/L的NH4Cl溶液配制基础发酵培养基，设置氨氮梯度0、0.5、1、2、5mg/L接种后，37℃、160r/min下培养，每隔1h取样，600nm下测定吸光度。

1.1.4 响应面分析 选择在实际生产中影响较大的温度、盐度、pH 3个因素，依据RSM中Box Behnken中心组合原则，采用Design Expert10.0软件进行分析。然后选用分析所得的最佳生长复合参数培养，并测定培养12h后培养液的OD600值（n=3）以证实该方法的可靠性。

1.2 數据处理 采用单因素方差分析（One-way ANOVA）法判断单因素不同浓度处理组之间的差异，统计分析通过Excel 2016和SPSS 20.0统计软件实现，差异显著水平为P<0.05。实验采用Design Expert 10.0软件进行数据处理，对温度、盐度和pH与芽孢杆菌生长响应值进行二次方程回归拟合，建立数学模型，用决定系数和回归方程的校正系数来判断数学模型的拟合程度，多变量方差分析决定方程的意义[9]。优化得到的实验条件重复3次，以验证模型的准确性。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离与筛选 样品接种于芽孢杆菌富集培养基进行培养，加热处理后经分离、纯化得到菌株。将菌株扩增培养后，涂在营养琼脂培养基上。该菌株单菌落呈灰白色、外形不规则、菌落边缘不整齐、表面皱褶较粗糙。

以该菌株DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，获得大小约1500bp的16S rRNA基因。经Blastn同源序列比较，表明YS-1菌株（MN841924）与Bacillus sp.相似度较高，且与登陆号为MH518191的Bacillus sp.菌株亲缘关系最近。MH518191，MK578252，KY621529与该菌株的16S rRNA基因的序列同源性超过99%，构建系统发育进化树，在细菌系统发育分类学上，可初步将该菌株归属芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

2.2 单因素实验

2.1.1 pH对芽孢杆菌生长的影响 由图2可知，YS-1菌株在pH为6.5～8.5范围内生长良好，4h后开始显著生长，进入对数生长期，7h后菌株生长进入稳定期，其中pH为7.5的实验组菌株生长最佳，5h后OD600值显著高于其它组（P<0.05），8h后OD600值稳定在0.8～0.85范围内。pH为6.5和8.5的实验组菌株也可生长，8h后OD600值稳定在0.69～0.73范围内。pH为5.5和9.5的实验组OD600值实验过程中无显著变化，强酸、强碱条件下菌株无法生长。

2.1.2 温度（T）对芽孢杆菌生长的影响 由圖3可知，YS-1菌株在温度为30℃～37℃范围内生长良好，2h后开始显著生长，进入对数生长期，7h后菌株生长进入稳定期，其中温度为37℃的实验组菌株生长最佳，2h后OD600值显著高于其它组（P<0.05），8h OD600值达到峰值0.89，8～12h内37℃组菌体的OD600值逐渐下降，到12h降至0.82。温度为30℃的实验组菌株，2h后开始显著生长，进入对数生长期，8h后OD600值稳定在0.84～0.86范围内。温度为25℃的实验组菌株，4h后开始显著生长，进入对数生长期，11h后OD600值稳定在0.91～0.93范围内。温度为15℃和20℃的实验组OD600值实验过程中无显著变化，低温条件下菌株无法生长。

2.1.3 盐度（S）对芽孢杆菌生长的影响 由图4可知，芽孢杆菌对盐度的适应范围很广，在0～45‰的盐度范围内均可生长，各组从3h开始逐步进入对数增长期。且盐度越低菌体的生长速度越快，5h各组之间出现显著性差异（P<0.05），盐度较高时，芽孢杆菌的生长速度受到抑制;8h时5‰组生长速度最快且达到最大值，菌体的OD600值约为0.84;12h时5‰和15‰组菌体的OD600值均可达到0.85，与其余各组之间存在显著性差异（P<0.05）。

2.1.4 转速对芽孢杆菌生长的影响 由图5可知，芽孢杆菌的生长速度与转速成正相关，即转速越快芽孢杆菌的生长速度越快。各实验组从5h开始，逐步进入对数增长期;7h后各实验组之间产生显著性差异（P<0.05），且转速越快菌体生长速度越快，240r/min下生长速度最快菌体的7h OD600值达到0.9;至12h各组之间差异极显著（P<0.01），转速为240r/min时菌株生长速度最快，12h菌株的OD600约为1.30。

2.1.5 碳源对芽孢杆菌生长的影响 由图6可知，YS-1菌株在葡萄糖浓度为0～0.2mg/L范围内生长良好，12h持续增长，12h后OD600值稳定在0.65～0.68范围内，各实验组之间不存在显著差异（P>0.05）。葡萄糖浓度为0.5mg/L的实验组菌株前期生长迅速，2h菌体的OD600值显著高于其它各组（P<0.05），但之后生长速度逐渐减慢，3～7h与其余各组之间差异不显著（P>0.05），8h后菌体的OD600值显著低于其它各组（P<0.05），OD600值稳定在0.40～0.43范围内。当葡萄糖浓度过高时，会对芽孢杆菌的生长起到抑制作用。

2.1.6 氨氮对芽孢杆菌生长的影响 由图7可知，YS-1菌株在NH4+浓度为0～2mg/L范围内可以生长，12h持续增长，12h后OD600值稳定在0.12～0.13范围内，各实验组之间不存在显著差异（P>0.05）。NH4+浓度为5mg/L的实验组OD600值实验过程中无显著变化，与其余各组存在显著性差异（P<0.05），高浓度NH4+条件下菌株无法生长。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面分析实验结果 根据单因素影响实验结果，我们选择合适的参数范围进行3因素3水平响应面设计与实验，其与结果见表1。利用Design expert 10.0统计软件对实验数据进行多元回归拟合，得到芽孢杆菌培养8h后的OD600值与x（温度）、x1（盐度）、x2（pH）之间的二元回归方程为：

OD600=1.08-4.900E-003x+0.0496x1-0.064x2+5.550E-003xx1+0.0735xx2-0.0411x1x2-0.13x2-0.046x12-0.089x22

对该模型进行方差分析见表2，结果表明，基于OD600值所建立的回归模型是显著的（P<0.05），失拟检测结果不显著（P>0.05），通过失拟检测，拟合方程有效。决定系数R2=0.9492，校正系数Adj R2=0.8838，拟合方程满足有效要求。

表3为回归模型系数显著性检验结果。由表3可以看出，盐度和pH的一次效应对芽孢杆菌的生长影响达到极显著水平（P<0.01），但温度的一次效应对其生长影响不显著（P>0.05）;温度、盐度和pH的二次效应对芽孢杆菌的生长影响都达到显著水平（P<0.05）;温度和pH之间的交互作用对特定生长率的影响达到极显著水平（P<0.01）。

2.2.2 菌体生长条件的优化 利用Design-Expert软件对表1的数据进行多元二次回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线见图8。等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示2个因素交互作用不显著，椭圆形表示2个因素交互作用显著[12]。从图8可以直观看出，温度和盐度、温度和pH以及盐度和pH对芽孢杆菌生长的交互作用显著。且x、x1、x2都存在极值点，利用Design-Expert软件对代表菌体浓度的OD600值的二次多项式数学模型解逆矩阵得知，3个因素的最优试验点（x、x1、x2）代码值（6.88、14.06、32.87），此时Y取最大值1.12。以响应面分析得到的芽孢杆菌最佳生长条件，做3次平行试验，验证试验结果。试验结果为1.18与预测相符，响应面分析方法可靠。

3 讨论与结论

对虾工厂化养殖具有更高的养殖密度，与传统粗放养殖相比可以提高养殖效率、获取更多的经济利益，但这必然伴随着高饵料投喂和严重的水体污染[10-12]。养殖水环境迅速恶化，产生的有机污染物和无机氮，对养殖生物有毒害作用。目前，使用微生态制剂已成为水产养殖中调节养殖水环境的重要手段，不但可以控制病害发生，还可以减少污染物的排放[13]。但随着微生态制剂使用规模不断扩大，微生态制剂对养殖环境缺少针对性的问题也逐步暴露出来，所以本研究以对虾工厂化养殖水体为样品来源，筛选出1株可适用于对虾工厂化养殖的芽孢杆菌YS-1，并根据16sRNA基因测序，将该菌鉴定为芽孢杆菌。

生物学特性研究表明，源自对虾工厂化养殖池的芽孢杆菌 YS-1同时对多种理化因子具有广泛的适应性，可见该菌株具有较强的环境适应能力，可用于扩大培养与广泛应用。由于菌株YS-1是工厂化对虾养殖的原生细菌，当作为微生态制剂应用于工厂化环境时，较其它来源的益生菌具有更强的适应能力、可以更有效改善水质。因此，芽孢杆菌YS-1的分离、筛选为对虾工厂化养殖微生态环境提供了优质的原生菌种，对维持养殖水体微生态平衡具有重大意义。

根据单因素实验结果可以看出，芽孢杆菌生长适应性较强。YS-1菌株在pH为6.5～8.5均可生长，但综合多因素条件时，在弱碱条件下生长受抑制，更适宜在弱酸条件下生长。这与之前的研究结果相吻合，已有研究报告表明[14-16]枯草芽孢杆菌在pH 7～9范围内生长较好，但也有学者表示[17]枯草芽孢杆菌更适宜在弱酸性条件下培养。YS-1菌株在温度25?37℃间的范围条件下都能生长，且温度越高生长速度越快，但温度达到37℃时，OD600呈现先升高后降低的趋势，表明菌株在这种温度下会迅速进入衰亡期。这与之前的研究结果相似，赵达[18]等研究表明35℃为枯草芽孢杆菌的最适生长温度。YS-1菌株在5～45‰的盐度范围内均可生长，在5～15‰的低盐度条件下生长较快。YS-1菌株在转速为120～240r/min均可生长，且转速越快生长速度越快，芽孢杆菌作为好氧微生物，高转速提供的高溶氧有利于其生长。这与之前的研究结果不同，赵达等[18]研究表明摇床转速为180r/min时最适宜芽孢杆菌的生长，随着转速的继续增加芽孢杆菌的生长受到抑制。

YS-1菌株在葡萄糖浓度0～0.2mg/L范围内可以生长，12h菌体的OD600约为0.65，当浓度达到0.5mg/L时芽孢杆菌生长受到抑制，12h菌体的OD600约为0.40。这与之前的研究结果不同，高磊等[19]研究表明表明高C/N更有助于异养微生物的生长，所以在养殖过程中加入蔗糖，提高碳氮比。本实验与其结果不同原因可能是培养基条件简单，葡萄糖浓度影响溶液渗透压抑制了芽孢杆菌的生长。YS-1菌株在NH4+浓度0～2mg/L范围内时，芽孢杆菌可以生长，当NH4+浓度达到5mg/L时，芽孢杆菌无法生长，说明当氨氮作为唯一氮源时，高浓度氨氮对芽孢杆菌有抑制作用。具有脂溶性的分子氨易透过膜结构进入细胞内，引起细胞死亡[20-21]，所以高浓度的NH4+浓度对芽孢杆菌有抑制作用。

温度、盐度、pH、转速及营养物质等多种理化因子对芽孢杆菌的生长都具有不同程度的影响，对其进行系统研究有助于深入了解芽孢杆菌在对虾工厂化养殖微生态系统中的生存生长条件。自20世纪70年代，科学界逐渐重视温度、盐度和pH这3种因子的作用[22-23]。郝林华等[24]采用单因素分析法研究了温度、pH和多种营养物质对芽孢杆菌生长的影响。而本研究不但分析了这6种因子的单因素作用效果，还选择3种在实际养殖中起决定性作用的因素，采用响应面分析法建立了多因素复合作用下芽孢杆菌的生长模型，获得了该菌的最佳培养参数。已有研究表明，使用响应面分析法优化微生物培养条件，可以有效提高目的产物的产量。李志华[25]使用响应面分析法对谷氨酸棒杆菌的培养条件进行了优化，有效提高了谷氨酸产量;黄丽金等[26]采用响应面分析法对德氏乳杆菌的培养条件进行了优化，产出菌液浓度提高了5倍。本实验结果表明，芽孢杆菌的最优培养条件为：pH 6.88、温度32.87℃和盐度14.06‰;此外，二次回归模型具有显著性（P<0.05），失拟检测结果不显著（P>0.05），方程通过失拟检测，表明拟合方程有效。决定系数R2=0.9492，校正系数Adj R2=0.8838，说明本实验所建响应面分析是可靠的。响应面分析法可以减少实验次数，同时考虑多因素之间的交互作用，拟合多元二次函数，直接反映因子与响应值之间的关系[27]。因此，新方法更直观的预测对虾工厂化养殖中环境因子的改变对芽孢杆菌生长动力学的影响。

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（责编：张 丽）