基于SSR分子标记对蒙古韭遗传多样性的研究

侯燕茹，宛 涛*，张晓明，王晓栋,2

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019； 2内蒙古自治区草原勘察规划院，内蒙古 呼和浩特 010051)

蒙古韭(AlliummongolicumRegel)是百合科葱属的多年生草本植物。主要分布在我国新疆、青海、甘肃、内蒙古等省区的荒漠草原地区。能够在干旱地区生长的植物，可以改善环境，提高环境质量，是解决沙化问题的有效途径之一〔1〕。蒙古韭具有较高的饲用，药用以及生态价值，也是家畜喜食的优良牧草，同时它独特的气味也可作为野生蔬菜食用〔2〕。本文以8个不同地理居群的120份蒙古韭作为研究材料，采用SSR分子标记法，筛选出多态性好的引物，对蒙古韭的遗传多样性进行研究，以期为蒙古韭的引种驯化及遗传育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料来自8个不同地理环境的居群，如表1所示。每个居群随机选取15份单株，共120份单株种子。2019年3月至9月，在室内进行试验，供试材料在温室中培养，待幼苗生长至7～10cm时(播种后约40d)剪下叶片以供使用或存放-80℃备用。

表1 供试材料信息

表2 供试材料地理分布表

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用改良后的CTAB法对叶片基因组DNA进行提取，后用琼脂糖凝胶电泳，检测其质量及含量，-20℃保存备用。

表3 引物及序列信息

1.2.2 引物筛选与PCR扩增

从40对葱类引物以及Kyung-Ho〔3〕和Lee〔4〕开发的7对SSR引物中，筛选出10对多态性较好且较为稳定的引物(表3)。初步选定最佳PCR扩增程序为：94℃，5min；94℃，30s；40～59℃，30 S；72℃ 1min，35个循环；72℃，7min；4℃保存。经过实验优化后的SSR-PCR反应体系：DNA模板1μ，上下游引物各1.5μL，mix(天根生化科技有限公司生产)7μL，ddH2O补足15μL后的反应效果最佳。最后从47对引物中筛选出条带清晰且多态性较好的引物。

1.2.3 PCR产物检测

扩增出的PCR产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。首先用剥离硅烷(500μL)涂抹凹板，用亲和硅烷(500μ)涂抹平板，待风干后将玻璃板固定灌入配好的丙烯酰胺凝胶，25～30℃放置60～90min，可将凝好的胶板直接使用或用保鲜膜封好4℃保存待用。电泳恒定电压190V，时间75min，待条带跑至胶板大约2/3处，然后采用银染色法显色。

1.3 数据处理

根据电泳结果，在凝胶相同迁移率位置上，染色结果有条带的记为“1”，无条带的记为“0”；运用Excel软件构成“0，1”矩阵。利用POPGENE version1.32软件计算有效等位基因数Ne、Nei’s遗传同一性、遗传距离、Nei’s遗传多样性指数、Shannon信息指数等指标，并利用NTSYS pc 21-2软件进行居群间的UPGMA(非加权组平均法)聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR引物标记多态性确定

使用筛选出的10对SSR引物，对8个居群的120份种质材料进行扩增，扩增出的多态性片段长度在40～400bp之间。共扩增出130条带，多态带为112条，多态带百分率变化范围在73.3%～100%之间。多态带百分率为100%的引物有4对分别是：SSR-3-、SSR-5-、AFS131和SSR-7-。其中引物GB-ASM-072C和AMS12扩增出的条带数最多，分别是16条和19条；引物AFS131扩增出的条带数最少，为8条。平均每对引物扩增出的多态性位点为11.2个，多态带占总条带的86%，说明10对引物的扩增效率很高且都具有较好的多态性，如表4所示。

表4 引物扩增情况

2.2 蒙古韭遗传多样性分析

表5中可以看出，在筛选出的10对引物标记下，120份单株材料的基因多样性水平变幅在0.1588-0.3956之间，平均为0.2987；Shannon信息指数介于0.2637～0.5790之间，平均为0.4599。10对引物的观测等位基因均为2，有效等位基因变化范围在1.2633～1.5956之间，平均值是1.4862与观测等位基因较为接近，说明等位基因均匀分布在群体中。多态信息指数(PIC)变幅在0.2490～0.4076之间。在多样性指标以及多态信息表达中，引物SSR-6-(I=0.5790，He=0.3946)标记下的120份单株材料体现出较高的遗传多样性。除引物B20F12之外，其他引物表现出的基因遗传多样性水平基本一致。

表5 基于SSR的引物多样性分析

120份蒙古韭基因多样性如表6所示。其中总基因多样性平均为0.3354，而居群内的基因多样性为0.1499；遗传分化系数平均为0.5532，即居群间的遗传变异占总变异的55.32%；表明蒙古韭遗传多样性主要存在于居群间，而居群内也存在一定的分化。各位点的基因流在0～13.0889之间，平均为0.4029。

表6 基因多样性分析

在10对引物的标记下，不同居群蒙古韭遗传多样性分析如表7所示。居群间基因多样性变幅处在0.0926～0.1743之间，平均为0.1498；Shannon信息指数的变幅在0.1394～0.2657之间，平均为0.2248。居群中有效等位基因变化范围为1.1582～1.3030，较高的是采自内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群，较低的是采自甘肃省武威市古浪县的蒙古韭居群。根据2种多样性指标可以看出，采自甘肃省武威市古浪县的蒙古韭居群的遗传多样性明显较低，采自内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗和内蒙古锡林郭勒盟多伦县的蒙古韭居群表现出较为丰富的基因多样性。

表7 遗传多样性分析

2.3 遗传距离分析

从表8中可以看出，各居群之间的遗传距离在0.1573～0.4748之间，而遗传一致度则在0.6220～0.8544之间。甘肃省武威市古浪县和甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾的蒙古韭居群遗传距离最大，为0.4748，它们之间的遗传一致度最低，为0.6220。内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗和甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾的蒙古韭居群之间的遗传距离最小，为0.1573，它们之间遗传一致度最大，为0.8544。

表8 Nei的同一性和遗传距离

注：遗传同一性(上对角线)和遗传距离(下对角线)

如表9所示，地理距离最近的是河北省承德市围场县和内蒙古锡林郭勒盟多伦县，为72km；最远的是甘肃省张掖市肃南县喇嘛和河北省承德市围场县，距离为1558km。遗传距离最近的是内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗和甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾的蒙古韭居群，最远的是甘肃省武威市古浪县和甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾的蒙古韭居群。遗传距离居群呈现出不一致的分布状态，说明地理距离对遗传距离的影响不大。

表9 居群间地理距离 单位：km

2.4 聚类分析

图1所示的UPGMA聚类图是依据Nei’s遗传一致度，对8个不同地理居群蒙古韭所进行的聚类。内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗和甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾居群蒙古韭居群首先相聚，然后和内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡镇的蒙古韭居群聚在了一起，再与内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群相聚，最后在较远的距离与甘肃省武威市古浪县的蒙古韭居群聚在一起。内蒙古锡林郭勒盟阿巴嘎旗的蒙古韭居群与内蒙古锡林郭勒盟多伦县的蒙古韭居群聚在一起，后又与河北省承德市围场县的蒙古韭居群聚在了一起。

表10 种源地地理及气候信息

且参照表10可以看出，聚类结果显示部分距离较近居群与年均温表现出较为一致性的变化趋势。聚为一类的内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗的蒙古韭居群、甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾居群蒙古韭居群、内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡镇的蒙古韭居群、内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群和甘肃省武威市古浪县的蒙古韭居群年均温依次为4.3<4.9<6.8<7.2，5.6(甘肃省武威市古浪县居群的遗传距离相对同一类群中其他4个居群距离较远)；聚为一类的内蒙古锡林郭勒盟阿巴嘎旗蒙古韭居群、内蒙古锡林郭勒盟多伦县的蒙古韭居群聚与河北省承德市围场县的年均温最低，依次为0.7<1.6<3.3。结合8个蒙古韭居群的地理分布表2分析得出遗传聚类结果与图中居群地理分布并未呈现规律性分布。

3 讨论与结论

3.1 讨论

遗传多样性的研究目前主要集中在分子水平、细胞水平和个体水平上，而分子标记技术已经成为当前研究遗传多样性的重要办法〔5〕。当前蒙古韭在分子水平上正处于初步研究的阶段，因而这方面的参考资料相对较为匮乏。本次研究对8个不同地理居群的蒙古韭进行了基因多样性分析，Shannon信息指数可以看出总的基因多样性平均为0.4599，与秦丽丽〔6〕的研究结果相比较，SSR分子标记法体现出更为丰富的遗传多样性。通过8个居群内基因多样性分析显示，除了位于纬度最低的甘肃省武威市古浪县和位于纬度最高的内蒙古锡林郭勒盟阿巴嘎旗表现出较低的多样性水平，其余地理居群基本一致，初步分析地理分布可能影响居群内基因多样性水平。有效等位基因数也可以反映群体遗传变异大小，研究结果显示有效等位基因数值接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布均匀。

对于居群而言，遗传结构是一个物种较为基本的特征，而基因流对其有着重要的影响。群体的遗传分化可以通过基因流的大小表达，群体的遗传结构又被群体的遗传分化状况所直接反映〔7〕。Ellstrand et al〔8〕认为当Nm>1时，基因流可以很好的抵制遗传漂变，同时能够有效防止群体之间的分化；当Nm<1时，遗传漂变导致了明显的群体间遗传分化，且植物种群的遗传分化也可以通过地理因子协同环境因子的作用而加强。研究结果显示蒙古韭的基因流为0.4039(Nm<1)。8个不同居群的120份材料平均分化系数为0.5532，说明群体间出现了较为明显的基因分化。导致这种结果可能是与物种的不同繁殖方式、散粉和种子传播机制、地理的特殊分布等有关。综合纬度、年均温、降水量、蒸发量和海拔等环境因素分析得出，8个居群的总体生境相差不大，基本上都位于荒漠草原地带，可能是导致基因分化的原因之一。同时也和人类生活活动密切相关，蒙古韭作为野生植物，目前还并没有被大量的开发使用。因而削弱了群体间的基因交流，且作为异交虫媒植物，传粉条件有限，也是可能是致使蒙古韭群体间出现较高的遗传分化现象的原因。

张莹花〔9〕在对蒙古韭的分布分析指出，蒙古韭主要分布在陕西、甘肃、宁夏、内蒙古、新疆、青海6省(区)，由蒙古韭不同群落的物种组成。本研究通过UPGMA聚类图将8个居群分为2个类群，表现出居群间的差异性。内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗的蒙古韭居群、甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾的蒙古韭居群、内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡镇的蒙古韭居群、内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗的蒙古韭居群和甘肃省武威市古浪县的蒙古韭居群聚为亲缘关系较近的一类，且甘肃省武威市古浪县的蒙古韭居群在这一类群中相比其他居群距离较远；内蒙古锡林郭勒盟阿巴嘎旗的蒙古韭居群、内蒙古锡林郭勒盟多伦县的蒙古韭居群、河北省承德市围场县的蒙古韭居群，聚为另一类。地理信息及分布图综合聚类结果分析得出，温度、纬度与遗传距离有着极为紧密的联系，且Jump的遗传多样性研究中也发现，有一个位点的频率变化与温度是极为相关的〔10〕。若遗传多样性在纬度梯度分布上与物种多样性存在一定程度上的一致，可能表明了，有一些驱动因素是共同存在于两者之间的〔11〕。研究结果显示部分居群遗传多样性在纬度梯度分布呈现一致。甘肃省张掖市肃南县喇嘛湾(I=0.1637)与内蒙古阿拉善盟阿拉善左旗(I=0.1690)纬度最相近，其基因多样性也最为接近，说明部分纬度相近的居群存在一定程度的共同驱动因素。根据地理信息表与聚类结果的综合分析，结果显示年均温度和纬度是遗传距离的重要影响因素。

3.2 结论

葱类SSR引物在蒙古韭材料中的适用性较低，47对引物中仅有10对表现较好，使用率为21%。Shannon信息指数所反映的基因多样性平均为0.4599，表明蒙古韭保持较为丰富的遗传多样性。遗传距离与地理生境有关，特别是与年均温、纬度等关系明显。内蒙古锡林郭勒盟苏尼特右旗居群内表现出较为突出的遗传多样性(He=0.1743，I=0.2657)，具有较高的引种驯化及遗传育种的科学价值。