水稻转基因成分快速检测方法基层应用分析

丁宁

摘要    水稻转基因越来越多地被广大群众所关注，農业农村部保持遏制非法转基因的高压态势，转基因成分检测成为县区级一项常规性检测任务，如何在速测过程中确保检测结果的准确性，避免假阳性或者假阴性成为基层工作者亟待解决的问题。本文重点介绍了基层主要检测转基因成分分类、安全性、现场稳定性、灵敏度、检测原理、检测步骤及应用，以确保结果的准确性、有效性和可比较性。

关键词    水稻;转基因;快速检测

中图分类号    S188        文献标识码    A

水稻是江苏第一大粮食作物，水稻质量安全问题对保障老百姓生活至关重要。对于水稻的转基因工作，2009—2018年每年农业部办公厅都发布关于开展农业转基因生物安全监管检查工作的通知，要求开展转基因监测工作;各省市每年都下发进行农业转基因生物监管工作的通知，开展转基因成分快速检测工作。从法律层面来讲，《农业转基因生物安全评价管理办法》（2017年11月30日修订版）第三十二条明确县级以上地方各级人民政府农业行政主管部门负责本行政区域内的农业转基因生物安全的监督管理工作[1];《农产品质量安全监管项目资金管理办法》第二章第四条规定农产品质量安全监管项目资金主要用于单独列出农业转基因安全管理，转基因安全例行监测及生产环境安全长期监测;行政执法、跨区监管及重点地区转基因安全专项检查[2]。宿迁市是苏北粮食生产大市，全市水稻种植面积21.47万hm2，品种多、乱、杂的局面没有完全改变。为了确保农业转基因生物安全，防止转基因水稻非法生产，保护生态环境，保障市民健康，开展水稻转基因检测，确保水稻生物安全性尤其重要，提升基层转基因工作监管能力成为亟待解决的问题。

1    水稻转基因成分分类

1.1    抗虫转基因

目前，在农业生产上使用比较多的是抗虫转基因和抗除草剂转基因，抗虫基因主要有Bt杀虫基因的cry1Ab、cry1Ac、cry1C和cry2A等十几种[3]，Cry1Ab和Cry1Ac是目前在作物转基因抗虫育种上应用最多的一类Bt杀虫蛋白，可以特异性地毒杀二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等水稻鳞翅目害虫，杀虫效果十分理想。

1.2    抗除草剂转基因

抗除草剂基因具有耐除草剂草甘膦特性的CP4 EPSPS、耐除草剂甲胺磷的特性的bar基因、抗除草剂溴苯腈基因（bxn基因）等，草甘膦是世界上使用范围最广的除草剂，其除草的作用机理是通过抑制莽草酸途中的EPSPS合酶，阻碍芳香族氨基酸的合成，扰乱植物正常的氮代谢而使其死亡[4-5]。

1.3    抗病转基因

张长伟[6]将苦瓜几丁质酶基因McCHIT1、苜蓿防御素基因alfAFP及其双价基因成功地导入水稻恢复系缙恢35中，得到了一批对稻瘟病、纹枯病抗性明显增强的植株后代。

1.4    抗逆性转基因

抗逆性转基因有耐冷、耐干旱、耐盐碱、耐淹等各类为了提高水稻品质而引入的抗逆性基因。

1.5    市面上主要转基因品种

目前，市面上存在的转Bt基因抗虫水稻有TT51-1（bt63）、Ⅱ优科丰6号、克螟稻和耐除草剂转基因水稻LLRICE62和LLRICE601等，是各基层监管单位进行监管的主要对象。

2    转基因安全性

据陈友倩等水稻转基因及其安全性研究进展介绍，转基因存在抗药性、过敏性、产生有毒物质、营养价值不良影响、生物多样性等安全性问题。

3    转基因速测卡现场稳定性和灵敏度

何  景等在转基因速测卡的现场应用性能及其可行性研究中得出，Cry1Ab/1Ac速测卡灵敏度最低可达0.25%，无交叉反应性，与Real-time PCR标准方法比对验证，同时对5种模拟实际样品进行检测分析，检测结果一致，能够满足达到准确检测的目的，适用于转基因成分的现场快速检测，检测灵敏度为100 μg/kg。

4    转基因成分速测原理

转基因速测的主要原理为利用双抗体夹心法，首先将转基因蛋白特异的抗体，偶联于显色试剂，并掺入试纸条，当试纸条被插入含有转基因蛋白的植物组织的少量萃取物时，偶联抗体与蛋白之间就发生了结合，与偶联于显色试剂上的某些但不是全部抗体形成夹心物。膜片含有2个捕获区，一个捕获区可捕获结合的转基因蛋白，另一个捕获区可捕获显色试剂。当夹心物和未反应的显色试剂被膜片上的特定区捕获时，这些捕获区就显现出红色。若膜片上仅存在1条红色对照线，说明受检样品为阴性样品;若存在2条线，说明受检样品为阳性样品[4-5]。

5    转基因成分检测步骤

5.1    取样

对区域内品种展示区、制种区、杂交稻种植区等进行集中采集，采集时做好GPS定位，并做好抽样单的填写。取样具体要求为取水稻叶片直径1 cm左右的圆形叶片组织2片，放到2 mL刻度尖底离心管中，或者取磨碎后的过100目的水稻种子0.25 g，用记号笔标注样品编号。

5.2    提取

每个水稻叶片样品中加0.20 mL主要成分为磷酸的提取缓冲液，用力上下振荡使样品和缓冲液充分接触混合，用玻璃棒捣碎，颜色变绿时可以准备检测;如果取样为水稻种子，则加主要成分为磷酸的提取缓冲液0.75 mL进行溶解，盖好盖子，进行上下振荡提取20～30 s，为了确保样品与缓冲液充分混匀，静置一段时间等待固体物质沉淀在管底，待上面澄清后就可以作为测试液进行测定，提取样品时要小心操作，避免交叉污染。

5.3    测定

速测试纸恢复至常温，放于水平桌面上，用枪吸75 μL蛋白样品上清液于底端或者将速测试纸按照箭头方向直接插入样品上清液中，试纸浸没入0.5 cm，不要超过箭头上端黑色标记线，从上样开始倒计时，结果在5～8 min内读取，否则判读无效，取出的速测纸要尽快使用，避免环境对速测纸产生不利影响。

5.4    结果判断

阴性样品T线不显色;阳性样品T线显色肉眼可见;无效样品显示为未出现T线上部的C线。

5.5    注意事项

一是在4～10 ℃条件下进行避光干燥保存，不能冷冻，试纸的有效期为12个月，拆封1 h内尽快使用，温度高于30 ℃或高湿度条件下要做到即开即用。二是样品中固体杂质颗粒会导致假阴性结果，取样时静置取上清液进行检测，必要时进行离心取上清液做检测。三是采用水稻植株样品进行转基因检测时，只需要变绿即可，不用太碎，液体太绿容易在条上吸附叶绿素，导致假阳性问题。

6    转基因速测应用

每年仅宿豫区转基因检测就至少有53个水稻品种，转基因速测具有用时短（只需要10～15 min）、操作简单、检测结果稳定、准确度高等特点，具有良好的现场应用性能，能够满足基层对生物安全性监测的要求。转基因速测技术是基层农业转基因监管的重要手段，切实提高了监管能力，同时持续强化研发、制种环节监管，查早查小，严厉打击违法违规行为，确保水稻生物安全性[6]。

7    参考文献

[1] 农业部科技教育局.农业部关于进一步加强转基因生物安全监管工作的通知[EB/OL].（2010-06-06）[2019-10-12].http：//jiuban.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201006/t20100606_1533955.htm.

[2] 农业部关于印发《农产品质量安全监管项目资金管理办法》的通知[EB/OL].（2017-12-05）[2019-10-12].http：//jiuban.moa.gov.cn/sjzz/cws/fagui/201712/t20171205_5962970.htm.

[3] 吴振映，柳絮.利用农杆菌介导法获得转cry2A抗虫基因水稻的研究[J].山东农业科学 2011（5）：1-3.

[4] 農业大省黑龙江明年5月起全面禁止转基因作物[EB/OL].（2016-12-17）[2019-10-12].http：//news.sohu.com/20161217/n476141506.shtml.

[5] 阮先乐，张杰.转基因成分的检测方法综述[J].江苏农业科学，2017，45（5）：12-15.

[6] 张长伟.转McCHIT1、alfAFP基因及其双价基因水稻的稻瘟病和纹枯病抗性研究[D].重庆：西南大学，2011.